卒中术后脑组织病理学评估 - TTC染色

本文节选自《实验卒中手术学》主编：杨国源

书号：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

       氯化三苯基四氮唑TTC（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride）染色是一种定量检测脑梗塞体积的迅速、方便、便宜、可靠的方法，它是一种用于评价组织内脱氢酶活性的标准染色方法。大脑切成2毫米的切片后，放入2%TTC溶液中，TTC能与正常线粒体氧化酶系统发生反应而降解成深红色，而梗塞部位受损以致线粒体缺乏降解TTC的酶的能力而不会被TTC染色，呈现白色，使得受损组织与正常组织极易区分开来。

       目前，很多学者釆用TTC染色标记脑组织缺血性损伤，计算脑梗死灶体积。该方法能清楚地区分正常脑组织和梗死脑组织的界线，但要求实验者在取材时要速度快，在极短时间内将组织投入TTC溶液中。组织中断血供时间过长，会造成新的损伤区域，致使测量出现较大误差，甚至组织完全不能染色。剥离和切片时应十分注意。因为脑组织十分脆软，容易出现碎裂，给测量带来不便（如下图所示）。

MCAO术后TTC染色

白色为梗塞部位；深红色为正常部位

一、实验材料

       1.TTC溶液。

       2.磷酸盐缓冲液。

       3.刀片。

       4.大脑模具。

       5.培养皿。

       6.载玻片。

       7.4%多聚甲醛。

二、TTC染色过程

       1.动物处死后，取脑并且小心地浸入低温磷酸盐缓冲液中。这样使大脑更加坚硬，方便切片。

       2.用刀片把大脑切成2毫米厚片。

       3.切片时要小心，因为脑组织容易粘在刀片上。为了防止损伤，刀片先浸入2%TTC溶液中。TTC溶液对光和热敏感，在不使用的时候要用铝箔包好。切好的脑片放入TTC溶液中进行染色并且持续观察颜色的改变。可以加热使这个过程变快，比如放入37℃的培养箱。

       4.当脑片表面开始变成粉红色，翻转脑片。染上色的是具有活性的脑组织。梗塞的部分由于线粒体失活，所以不能被染色，仍然为白色。

       5.当脑片变成红色，反应结束，用磷酸盐缓冲液洗去TTC溶液。

       6.脑片要进行拍照，来确定梗塞量。也可以把脑片放入多聚甲醛中过夜进行固定。这样拍照更加方便。此步一定要注意避光，否则染色还会褪色。

三、应用TTC检测的注意点

       1.TTC染色是计算梗塞量的标准方法。

       2.TTC溶液对光敏感，因此要避光保存。

       3.染色前是否进行磷酸盐缓冲液灌注不影响实验的结果。

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1.冰冻切片苏木素伊红染色

1、将4%多聚甲醛灌注后的大脑，用冰冻切片机切片，厚度为10~40微米。

2、将脑片贴在载玻片上，并且吹干过夜。

3、将脑片脱脂（若是脑组织直接冰冻，则不需要脱脂）：

       （a）将脑片浸没在氯仿和乙醇混合物中至少1小时。

       （b）将脑片分别在、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分钟，然后用蒸馏水冲洗。

注意：必须等到片子完全干燥（没有水滴）。如果脑片是几天前准备的，在染色之前必须放到蒸馏水中浸泡5分钟。

4、染色步骤：

       （a）将苏木素滴在脑片上，染色20~25分钟。整个过程用眼睛或显微镜观察，保证细胞核变蓝。

       （b）用蒸馏水洗2次。

       （c）用0.25%的氨水溶液轻轻冲洗约10秒。

       （d）用蒸馏水洗2次。

       （e）用伊红染色10秒

       （f）用蒸馏水洗2次。

       （g）用70%、80%、90%、95%、的乙醇脱水1次，每次3分钟。

       （h）用乙醇与二甲苯混合液脱水3分钟。

       （i）用二甲苯处理5分钟

       （j）滴2~3滴封片剂，用盖玻片封住脑片，准备在显微镜下观察。

2.石蜡切片的苏木素-伊红染色

1、修剪组织：如果大脑固定在4%6的多聚甲醛里，那么修剪组织必须在通风橱里进行。去除小脑和嗅球部分。大脑用水冲洗干净，冠状切片切成3份。组织放在生理盐水中。

2、处理以及石蜡包埋：在自动包埋机上进行包埋。金属盒放在机器中过夜。组织进行梯度脱水，并用石蜡进行包埋。

3、组织包埋的步骤:

       （a）加热温度控制在59~61℃；

       （b）样品控制台温度在59~61℃；

       （c）冷冻台温度为5℃；

       （d）组织转移到加热台上，浸在石蜡中，然后移至样品控制台。

注意：不要把样品放反了，同时要保持它们的方向一致。把铁块放在冷冻台上，冷却20分钟。

4、室温下在切片机上切片：

       （a）水浴温度控制在45~50℃。

       （b）石蜡组织放在冰水混合物中。

       （c）室温下设置好切片机。

       （d）45℃，吹干载玻片20分钟。

       （e）蜡块固定在切片机上，修整蜡块表面，直至大脑组织出现。

       （f）切片，厚度可根据试验要求，切成4~10微米。

       （g）脑片转移到水浴中，然后贴在载玻片上。

5、预染：载玻片在60℃的烘箱中烤片15分钟，融化石蜡，使乙醇挥发。注意用架子架住载玻片。

6、HE染色：可以自动也可以手动进行。

1）自动：染色在染色机中进行，依次用以下溶液处理：

       （a）3次二甲苯；

       （b）2次乙醇；

       （c）2次95%乙醇；

       （d）苏木素染色；

       （e）2次95%乙醇；

       （1）70%乙醇；

       （g）伊红染色；

       （h）70%乙醇；

       （i）3次二甲苯。

2）手动：每一步骤约1~2分钟，整个过程需要25~30分钟。载玻片放入盒子中，滴2~3滴封片剂，然后用盖玻片小心地盖在上面。

① 注意事项：

       （a）封片前片子不要干燥，封片剂将地封住脑片；

       （b）在完全干燥之前保证片子平整；

       （c）在显微镜下观察片子的染色效果。例如：如果组织在冰盒中的浸泡时间不足够长，组织看起来会有皱褶。如果漂片温度太高，片子会碎，如果温度太低，片子不能漂浮。

② 手动的HE染色方法：

       （a）3次二甲苯，每次2分钟，脱去脂肪和蜡；

       （b）乙醇，每片10滴；

       （c）95%乙醇，2次，每片10滴；

       （d）蒸馏水洗；

       （e）苏木素染色15分钟；

       （f）蒸馏水洗2次；

       （g）0.25%氨水洗，直至组织变蓝；

       （h）蒸馏水洗2次；

       （i）0.5%的伊红染色，每片10~20滴；

       （j）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴；

       （k）乙醇，每片10滴；

       （l）3次二甲苯，每片10滴。

苏木素伊红染色后细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色或红色。如下图所示：

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凭借显著优化视野的高jingzhun性和同步性，眼科手术显微镜术中OCT成像系统可以帮助眼科医生在眼科手术中实现高水准的手术效果。

眼外科医生分享了在白内障和视网膜手术中使用眼科手术显微镜术中OCT的经验。

关键经验

眼科手术显微镜有一种内置术中OCT的高级成像解决方案，设计用于改善眼前后节手术的工作流程，实现高精准度。

医生分享了在白内障手术中使用眼科手术显微镜术中OCT成像系统的体验。医生特别强调了使用这款成像解决方案在检测和处理残余晶状体碎片的优势。由于这些晶状体碎片会被手术切口或水肿遮挡，因此很难看到。眼科手术显微镜术中OCT可以有效定位残留晶状体碎片，从而改善手术效果，降低术后并发症和二次手术的风险。

关 于 EnFocus

EnFocus是用于眼科手术显微镜的术中OCT。它可以呈现出高度清晰的实时眼前节和眼后节图像，便于观察眼底下表面显微结构。除了角膜移植术和白内障手术，在角膜、青光眼和视网膜手术中，术中OCT同样可以提供相同的优势。它也是基因治疗中一项重要的辅助工具。EnFocus可以结合眼科手术显微镜使用，提供全面的可视化效果。

免责声明：本文中医疗专业人员的陈述和解释仅代表其个人观点和经验，并不代表其所属机构的观点。

残留晶状体碎片评估

除了视网膜手术这一典型的适用领域，术中OCT在白内障手术中也能够发挥重要的作用，尤其是用于评估残留晶状体碎片。

手术结束时，我怀疑存在晶状体碎片。借助术中OCT，可以突出显示残留碎片。碎片尺寸较大，隐藏在主切口的水肿后面。

当碎片尺寸相对较小，隐藏在辅助切口后面。然而，这些碎片受切口附近的角膜水肿影响，很难发现。这时候术中OCT便可以发挥重要的作用。

一般是对眼后节进行360°环形扫描。使用显微镜脚踏开关，可以返回手术区域并分析图像。这样就可以看到辅助切口水肿后面有一个隐藏的残留碎片。

在别的眼科手术中也能看到虹膜角膜角度有微小的残留碎片。

术中OCT的优势

在眼科手术中，术中OCT可以在白内障手术中发挥重要的作用。医生可以用它发现残留碎片，避免几天或几周后进行二次手术，还可以减少术后并发症。所以说，术中OCT是一种提高白内障手术质量和完善性的有效工具。