机器人定向脑组织修复术好不好？

本文节选自《实验卒中手术学》主编：杨国源

书号：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

氯化三苯基四氮唑（TTC）染色

       氯化三苯基四氮唑TTC（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride）染色是一种定量检测脑梗塞体积的迅速、方便、便宜、可靠的方法，它是一种用于评价组织内脱氢酶活性的标准染色方法。大脑切成2毫米的切片后，放入2%TTC溶液中，TTC能与正常线粒体氧化酶系统发生反应而降解成深红色，而梗塞部位受损以致线粒体缺乏降解TTC的酶的能力而不会被TTC染色，呈现白色，使得受损组织与正常组织极易区分开来。

       目前，很多学者釆用TTC染色标记脑组织缺血性损伤，计算脑梗死灶体积。该方法能清楚地区分正常脑组织和梗死脑组织的界线，但要求实验者在取材时要速度快，在极短时间内将组织投入TTC溶液中。组织中断血供时间过长，会造成新的损伤区域，致使测量出现较大误差，甚至组织完全不能染色。剥离和切片时应十分注意。因为脑组织十分脆软，容易出现碎裂，给测量带来不便（如下图所示）。

MCAO术后TTC染色

白色为梗塞部位；深红色为正常部位

一、实验材料

       1.TTC溶液。

       2.磷酸盐缓冲液。

       3.刀片。

       4.大脑模具。

       5.培养皿。

       6.载玻片。

       7.4%多聚甲醛。

二、TTC染色过程

       1.动物处死后，取脑并且小心地浸入低温磷酸盐缓冲液中。这样使大脑更加坚硬，方便切片。

       2.用刀片把大脑切成2毫米厚片。

       3.切片时要小心，因为脑组织容易粘在刀片上。为了防止损伤，刀片先浸入2%TTC溶液中。TTC溶液对光和热敏感，在不使用的时候要用铝箔包好。切好的脑片放入TTC溶液中进行染色并且持续观察颜色的改变。可以加热使这个过程变快，比如放入37℃的培养箱。

       4.当脑片表面开始变成粉红色，翻转脑片。染上色的是具有活性的脑组织。梗塞的部分由于线粒体失活，所以不能被染色，仍然为白色。

       5.当脑片变成红色，反应结束，用磷酸盐缓冲液洗去TTC溶液。

       6.脑片要进行拍照，来确定梗塞量。也可以把脑片放入多聚甲醛中过夜进行固定。这样拍照更加方便。此步一定要注意避光，否则染色还会褪色。

三、应用TTC检测的注意点

       1.TTC染色是计算梗塞量的标准方法。

       2.TTC溶液对光敏感，因此要避光保存。

       3.染色前是否进行磷酸盐缓冲液灌注不影响实验的结果。

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本文节选自《实验卒中手术学》主编：杨国源

书号：ISBN 978-7-5046-6264-4/R·1648

1.冰冻切片苏木素伊红染色

1、将4%多聚甲醛灌注后的大脑，用冰冻切片机切片，厚度为10~40微米。

2、将脑片贴在载玻片上，并且吹干过夜。

3、将脑片脱脂（若是脑组织直接冰冻，则不需要脱脂）：

       （a）将脑片浸没在氯仿和乙醇混合物中至少1小时。

       （b）将脑片分别在、95%、70%和50%的乙醇中各浸泡5分钟，然后用蒸馏水冲洗。

注意：必须等到片子完全干燥（没有水滴）。如果脑片是几天前准备的，在染色之前必须放到蒸馏水中浸泡5分钟。

4、染色步骤：

       （a）将苏木素滴在脑片上，染色20~25分钟。整个过程用眼睛或显微镜观察，保证细胞核变蓝。

       （b）用蒸馏水洗2次。

       （c）用0.25%的氨水溶液轻轻冲洗约10秒。

       （d）用蒸馏水洗2次。

       （e）用伊红染色10秒

       （f）用蒸馏水洗2次。

       （g）用70%、80%、90%、95%、的乙醇脱水1次，每次3分钟。

       （h）用乙醇与二甲苯混合液脱水3分钟。

       （i）用二甲苯处理5分钟

       （j）滴2~3滴封片剂，用盖玻片封住脑片，准备在显微镜下观察。

2.石蜡切片的苏木素-伊红染色

1、修剪组织：如果大脑固定在4%6的多聚甲醛里，那么修剪组织必须在通风橱里进行。去除小脑和嗅球部分。大脑用水冲洗干净，冠状切片切成3份。组织放在生理盐水中。

2、处理以及石蜡包埋：在自动包埋机上进行包埋。金属盒放在机器中过夜。组织进行梯度脱水，并用石蜡进行包埋。

3、组织包埋的步骤:

       （a）加热温度控制在59~61℃；

       （b）样品控制台温度在59~61℃；

       （c）冷冻台温度为5℃；

       （d）组织转移到加热台上，浸在石蜡中，然后移至样品控制台。

注意：不要把样品放反了，同时要保持它们的方向一致。把铁块放在冷冻台上，冷却20分钟。

4、室温下在切片机上切片：

       （a）水浴温度控制在45~50℃。

       （b）石蜡组织放在冰水混合物中。

       （c）室温下设置好切片机。

       （d）45℃，吹干载玻片20分钟。

       （e）蜡块固定在切片机上，修整蜡块表面，直至大脑组织出现。

       （f）切片，厚度可根据试验要求，切成4~10微米。

       （g）脑片转移到水浴中，然后贴在载玻片上。

5、预染：载玻片在60℃的烘箱中烤片15分钟，融化石蜡，使乙醇挥发。注意用架子架住载玻片。

6、HE染色：可以自动也可以手动进行。

1）自动：染色在染色机中进行，依次用以下溶液处理：

       （a）3次二甲苯；

       （b）2次乙醇；

       （c）2次95%乙醇；

       （d）苏木素染色；

       （e）2次95%乙醇；

       （1）70%乙醇；

       （g）伊红染色；

       （h）70%乙醇；

       （i）3次二甲苯。

2）手动：每一步骤约1~2分钟，整个过程需要25~30分钟。载玻片放入盒子中，滴2~3滴封片剂，然后用盖玻片小心地盖在上面。

① 注意事项：

       （a）封片前片子不要干燥，封片剂将地封住脑片；

       （b）在完全干燥之前保证片子平整；

       （c）在显微镜下观察片子的染色效果。例如：如果组织在冰盒中的浸泡时间不足够长，组织看起来会有皱褶。如果漂片温度太高，片子会碎，如果温度太低，片子不能漂浮。

② 手动的HE染色方法：

       （a）3次二甲苯，每次2分钟，脱去脂肪和蜡；

       （b）乙醇，每片10滴；

       （c）95%乙醇，2次，每片10滴；

       （d）蒸馏水洗；

       （e）苏木素染色15分钟；

       （f）蒸馏水洗2次；

       （g）0.25%氨水洗，直至组织变蓝；

       （h）蒸馏水洗2次；

       （i）0.5%的伊红染色，每片10~20滴；

       （j）95%乙醇，洗2次，每片10~15滴；

       （k）乙醇，每片10滴；

       （l）3次二甲苯，每片10滴。

苏木素伊红染色后细胞核呈蓝色，细胞质呈粉红色或红色。如下图所示：

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