如何制备密度梯度离心液？

　　此次实验主要是为膝关节滑液组织制备单细胞，让我们一起来看看净信单细胞制备仪是如何制备膝关节滑液组织单细胞悬液，对其样品前处理效果和悬液效果如何？

　　实验地点：上海**大学医学院东区单细胞中心

　　实验仪器：单细胞悬液制备仪（温控型）JX-CKSM-6WK

　　样品前处理制备实验步骤：

　　1、打开仪器电源开关，将仪器界面中的加热点开预热一段时间持恒温。

　　2、将组织稍微剪切成小块，放入净信2ml研磨管中。

　　3、加入净信消化酶旋上盖子，上下微微晃动将其组织和消化酶均匀混合。

　　4、将混合好的研磨管放入加热模块中，再将研磨管放入热板中，盖上盖子。

　　5、启动设备，待设备停止运行后打开仪器盖子，取出样品管

　　6、将样品管中的液体和剩下的组织一起倒入过滤管中，再加入终止液后得到浑浊的液体，即单细胞悬液。

　　样品处理前后效果图：

　　显微镜下的细胞呈现：

　　实验样品组织制备注意事项：

　　1、消化酶和终止液均需要在冷冻环境下保存

　　2、消化酶解冻时需在常温条件下解冻，不可以放入水浴或者其他加热仪器中解冻，温度升高对酶的活性会有很大的影响。

实验目的：制备小鼠大脑的单细胞悬液

实验仪器：单细胞悬液制备仪，研磨套装管，滤管，移液枪，培养皿，镊子，手术刀

实验试剂：PBS液，净信消化酶，终止液

操作步骤：

1、开机预热，打开加热模块1，加热模块2

2、取活体组织后，放入PBS液中去红，然后取20-50mg（约小米粒大小），再分成若干等分

3、把消化酶用移液器加入研磨套装管中，将加满消化酶的离心管放入预热模块中预热几分钟

4、将处理好的组织用镊子转移到加满消化酶的离心管中

5、将装满消化酶和组织的离心管放置到加热板中，选择25分钟程序，开始运行

6、程序结束取出离心管，将消化好的组织液转移到过滤管中，即得到一管单细胞悬液

仪器介绍：

上海净信单细胞制备仪JX-CKSM-6WK（6通道加热型）是一种集成金属浴消化与温和剪切组织的新一代细胞悬液制备设备，应用于流式细胞术/单细胞测序/原代细胞培养等实验，具有起始组织量小，时间短，细胞得率高，细胞活性高的特点。采用国际DIN方法设计，低噪音，使用方便，性能稳定。

应用领域：肿瘤研究 心血管研究 干细胞研究 免疫研究 神经科学研究

产品应用：

单细胞测序（Single-Cell RNASeq)

多色流式分析（Multicolor Flow Cytometry)

质谱流式细胞计数（Mass Cytometry)

原代细胞分离培养（Primary Cell Isolation And Culture)

细胞ZLCAR-T

作为构成神经系统的基本结构和功能单位，神经细胞的体外分离、培养在神经科学研究中占据前沿地位。由于神经元分离后不会再次分裂、增殖，因此在进行相关细胞实验时，需要高效地制备高质量原代神经细胞保证实验材料的供应。

然而神经细胞的分离制备难度较大，相较于新生鼠，成年鼠脑的解离更复杂，需要机械和酶解联合作用来降解细胞外基质，同时大量的髓鞘碎片和红细胞也会干扰下游实验。

那么，如何快速制备高质量的大/小鼠神经细胞悬液样本呢？接下来，我们从实验仪器及材料、实验步骤和实验结果一一介绍，希望对你的实验有所帮助。

实验仪器及材料

瑞沃德 DSC-400单细胞悬液制备仪；

瑞沃德 HJ-400 加热套；

瑞沃德 DHABE-5003大小鼠成年脑组织温和酶解试剂盒；

瑞沃德 SCT-100组织处理管；

70μm 细胞滤器；

瑞沃德眼科手术器械；

细胞培养耗材、移液枪等。

实验步骤

1、按照说明书要求，混合配置酶mix并37℃水浴激活。

2、剥离成年鼠（P>7）脑组织，暂存至盛有HBSS（含Ca2+和Mg2+）的培养皿中，用眼科镊轻轻地将脑组织的血管尽可能去除。

尽可能剔除脑组织上的血管

3、将脑组织和酶mix放于组织处理管中，用剪刀将全脑简单剪成4块。

4、将组织处理管倒置至单细胞悬液制备仪上，安装加热套，运行程序 M_ABrain_Heater_2。

5、润湿细胞滤器，过滤细胞悬液样本，300×g ，离心10 min。

使用细胞筛过滤杂质

6、转移细胞样本至15mL离心管，加入去碎片试剂后混匀，上层铺预冷的PBS，3000×g， 4℃，升速为5，降速为3，离心10min，保留下层细胞后洗涤收集。

去除碎片，收集下层细胞

7、裂红操作（可选）。

8、细胞计数及流式检测。

实验结果

使用瑞沃德单细胞悬液制备仪处理成年小鼠脑组织获得的细胞可达90%，细胞活性高，不影响下游实验。瑞沃德 DHABE-5003大小鼠成年脑组织温和酶解试剂盒，可用于成年大鼠或小鼠(P>7)全脑组织的单细胞悬液制备，可支持脑内所有神经及非神经细胞的分离。

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