如何使淋巴细胞分离液密度梯度离心后分离的细胞层明显清晰

液-液萃取是指两个完全不互溶或部分互溶的液相接触后，一个液相中的溶质经过物理或化学作用另一个液相，或在两相中重新分配的过程。
 
在大抄部分情况下，一种液相是水溶剂，另一种液相是有机溶剂。溶质，在不同的溶zhidao剂中溶解度相差很大，通过液相混合，溶质从一种液相转移到另一种液相。原始溶液中溶质含量很少。

萃取过程的条件

1 ．两个接触的液相完全不互溶或部分互溶；

2．溶质组分和稀释剂在两相中分配比不同；

3．两相接触混合和分相；

4．溶剂A和B   对溶质S的溶解能力不一样，溶剂具有选择性。 

原代细胞 (primary cell) 是指从机体的组织（如人体组织、小鼠组织等）经特定方法获得单个细胞，并在体外进行模拟机体培养的细胞。原代细胞离体时间较短，生物学特性未发生较大变化，仍保有机体组织的遗传特征，能更好地反映细胞在体内的生长状态，因此可获得与体内生理功能更接近的数据，更适合用于药物测试、细胞分化和转化等实验研究。

原代细胞分离是指使用酶、螯合剂（常用EDTA）以及机械方法处理动物组织，使其分散为单细胞悬液样品，后续在适当的培养体系下使分离的原代细胞进行生存、生长和繁殖的过程。针对不同物种的不同组织类型，其具体的操作流程也要进行调整，常规原代细胞分离流程为取样→预处理→分离处理→过滤清洗→后处理。

01

取样→预处理

取样是原代单细胞悬液制备非常重要的一步，其质量会直接影响到后续处理效果。

操作时，首先根据不同实验需求麻醉或处死动物后进行消毒、固定并切开相应位置皮肤暴露目的组织。

（▲暴露目的组织）

同时不同组织类型，取样时也有细微差别。

其次操作过程中有以下几点也需要注意：

• 严格无菌操作，快速处理；

• 针对不同组织类型控制环境温度；

• 保证工具锋利，减少机械损伤，动作轻柔，保持组织湿润；

• 尽量去除非相关组织，尤其是残留的小血管等；

• 完整记录组织情况、重量等信息。

拿到样本后针对不同分离流程选择不同的预处理方式（如将肿瘤组织剪切到2-4mm左右的小块），如血液细胞等已经是单细胞悬液的样本在简单的离心换液过后就可以直接使用了，其他类型的组织还需要进一步解离。

（▲组织预处理）

02

分离处理

常规组织处理一般有两种方法，分别是通过物理机械剪切和化学生物酶解来实现细胞分离。

物理机械剪切是使用匀浆机打散组织或者使用剪刀、铜网或者组织研磨器进行的剪碎法、网搓法和研磨法。这种方法成本低，操作简单、快速，但对组织机械损伤巨大，而且细胞分散效果不尽人意，只适用于一些质地软且较为松散的软组织。

化学生物酶解法是组织样本预处理之后，在酶的作用下，破坏组织间的胶原纤维和弹性纤维，同时水解粘多糖及其他连接细胞间的蛋白质；或者通过EDTA等化学物质与细胞上的钙、镁离子结合形成螯合物，利用结合后的机械力使细胞变圆而分散细胞，尤其对上皮组织的分散效果很好。

使用酶解体系进行组织解离时还需注意酶的选择和配比，最常使用胰蛋白酶和胶原酶进行处理。其中胰蛋白酶对蛋白质有水解作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质消化溶解而使细胞分散开，适用于多种组织。

胶原酶是一种从细菌中提取出来的酶，对胶原有很强的消化作用。适用于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织，它对细胞间质有较好的消化作用。不同的胶原酶适用的组织也会有不同。

除上述两种最常用的消化酶外，还有链霉蛋白酶这种解离效果强但容易造成细胞损伤以及解离效果弱，但对细胞损伤较小的裂解酶，可以根据实际样本的情况进调整，或者通过复配联用达到更好的效果，例如可以使用透明质酸酶与胶原酶联用消化细胞间基质等。

同时，在进行消化处理的时候佐以机械剪切，便能使组织分散得更加均匀，样本处理效果更好。另外实验操作中还需要注意以下几点：

• 预处理好的组织块需要在缓冲液中清洗，避免影响后续实验；

• 酶量和作用时间应根据组织量及时调整，避免消化时间过长影响细胞状态，期间需要摇晃整个解离体系以保证组织块接触均匀；

• 严格控制温度湿度条件，虽然胰蛋白酶发挥效果的最佳温度是56℃，但是细胞无法承受如此高温，所以需要在37℃环境进行处理，另外还有部分组织需要冷消化处理；

• 酶的保存也需要注意，冻干粉要注意防潮，溶解后避免反复冻融，如蛋白水解酶可以自动分解，因此建议在使用前立即将其溶解，并在冰上保存2°C～8°C。

原代细胞分离过程复杂，同时整个分离处理过程都需要人工参与，机械剪切过程难以控制实验可重复性。随着科技的进步，瑞沃德单细胞悬液制备仪轻松化解这一难题，自主研发的组织处理管、酶解试剂盒和内置不同组织优化处理程序，可将组织制备成高活性单细胞悬液或组织匀浆。

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03

过滤清洗→后处理

在分离处理操作结束后要对样品进行过滤、离心、换液，对获得的单细胞悬液进行细胞计数和活力分析，终止反应并将细胞置于培养体系或相应的缓冲体系中。

（▲活细胞计数）

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