微量凯氏定氮法测蛋白质含量过程中产生误差的原因有哪些？

1 前言

小麦胚粉是以小麦胚芽为主要原料，经科学灭活加工而成，是一种蛋白质和维生素含量都比较高，而热量脂肪和胆固醇都相对比较低的一种营养品。参照《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质含量检测》测定小麦胚粉中的蛋白质。

2 仪器与试剂

2.1 仪器

K1160 全自动凯氏定氮仪，SH420F 石墨消解仪，分析天平。

2.2 试剂

硫酸（分析纯），催化剂片（分析纯无水硫酸钾 3g 和分析纯无水硫酸铜 0.2g），20g/L硼酸溶液，溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，40%氢氧化钠。

3 实验方法

3.1 取样

将样品外包装打开，混匀样品，精确称取 0.2g 左右（精确值 0.1mg），用称量纸包好放入消化管内，然后分别加入 3g 硫酸钾与 0.2g 硫酸铜，沿消化管壁加硫酸 10mL。

3.2 消解

利用石墨消解炉进行消解，将消化管放在石墨炉上，盖上排气罩，连接废气吸收系统，消化过程采用曲线升温模式，设定消解参数如表 1：

表 1 消解参数设置

3.3 测试

将消化管放置于凯氏定氮仪上，定氮仪参数设置如表 2：

表 2 定氮仪参数设置

4 测试结果

4.1 实验结果

4.2 结论

通过实验数据可以看出，测定小麦胚粉的粗蛋白平均值为 27.2027%。以上数据显示，使用 K1160 全自动凯氏定氮仪测定小麦胚粉中的蛋白质所得结果误差符合《GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》标准要求的两个测定值的JD差值不得超过算术平均值的 10%。

参考文献

[1] GB 5009.5-2016 食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定[S].

导读

超微量分光光度计常用于核酸纯度分析、蛋白定量以及细菌生长浓度的定量，蛋白质重复性不好是我们遇到的最多的问题。

今天，我们从超微量分光光度的测样原理来分析一下这个问题。

一般来说，在进行超微量分析时，需要用移液枪将1-2 μL的蛋白质样品加到样品台上。

利用蛋白质的表面张力，采用样品拉伸原理，使样品形成液柱，从而进行检测。

殊不知这个过程就是影响蛋白质测定准确性和重复性不好的关键因素，几乎可以影响到蛋白质表面张力的因素都可导致其测试结果的不稳定。

现将这些因素总结如下：

元析B-600超微量分光光度计主机

B-600超微量分光

光度计蛋白质测量方法界面

01

温度导致样品挥发

首先，液体的温度与分子间引力有一定的关系。

温度升高，分子间引力将减弱，表面张力也会随之降低。这也解释了为何低温保存的核酸样品，更易形成液柱。

所以，要得到理想的测试效果，首先要确保实验室环境的温度和湿度，要预防仪器本身的发热对样品的影响。

然而，一款拥有封闭式点样台的超微量分光光度计可避免这一问题。

02

盐

无机盐作为一种非表面活性剂，具有水合作用，趋向于把水分子拖入水中,因此会增大表面张力，反之亦然。

因此，脱盐或低盐的样品，表面张力会降低，常见于蛋白纯化的流程。

例如在进行蛋白质结构分析或质谱分析时，样品需经过脱盐处理，这样的样品在进行浓度测量时，并不容易形成液柱。

03

表面活性剂

蛋白提取过程中经常使用的表面活性剂（清洁剂），如SDS、Triton X100，会大幅降低样品的表面张力，这些物质常会残留在样本中，难以完全去除。

尤其一些非离子型表面活性剂对蛋白质在界面吸附性的影响更加值得考虑。

04

固液接触表面

当使用移液器将微量样品加载到点样台后，会出现液体与固体的接触表面，点样台表面的亲水/疏水性质会影响液体的表面张力。

因此，使用拉伸法的主流品牌微量分光光度计，点样台表面具有疏水性涂层，会增大液体的张力。