elisa步骤

　　ELISA实验原理：ELISA的原理、类型及操作步骤

　　ELISA的原理

　　ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

　　ELISA方法类型和操作步骤

　　elisa可用于测定抗原，也可用于测定抗体。在这种测定方法中有3种必要的试剂：①固相的抗原或抗体，②酶标记的抗原或抗体，③酶作用的底物。根据试剂的来源和标本的性状以及检测的具备条件，可设计出各种不同类型的检测方法。

　　(一)双抗体夹心法

　　双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法，操作步骤如下：

　　(1)将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体：洗涤除去未结合的抗体及杂质。

　　(2)加受检标本：使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。

　　(3)加酶标抗体：使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。

　　(4)加底物：夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

　　根据同样原理，将大分子抗原分别制备固相抗原和酶标抗原结合物，即可用双抗原夹心法测定标本中的抗体。

　　(二)双位点一步法

　　在双抗体夹心法测定抗原时，如应用针对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为固相抗体和酶标抗体，则在测定时可使标本的加入和酶标抗体的加入两步并作一步。这种双位点一步不但简化了操作，缩短了反应时间，如应用高亲和力的单克隆抗体，测定的敏感性和特异性也显著提高。单克隆抗体的应用使测定抗原的ELISA提高到新水平。

　　在一步法测定中，应注意钩状效应(hookeffect)，类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象。当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。

　　(三)间接法测抗体

　　间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。操作步骤如下：

　　(1)将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原：洗涤除去未结合的抗原及杂质。

　　(2)加稀释的受检血清：其中的特异抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后，固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及血清中的杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。

　　(3)加酶标抗抗体：与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接dibiao记上酶。洗涤后，固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。例如欲测人对某种疾病的抗体，可用酶标羊抗人IgG抗体。

　　(4)加底物显色：颜色深度代表标本中受检抗体的量。

　　本法只要更换不同的固相抗原，可以用一种酶标抗抗体检测各种与抗原相应的抗体。

　　(四)竞争法

　　竞争法可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。操作步骤如下：

　　(1)将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体。洗涤。

　　(2)待测管中加受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，保温后，酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤。

　　(3)加底物显色：参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差，代表受检标本抗原的量。待测管颜色越淡，表示标本中抗原含量越多。

　　(五)捕获法测IgM抗体

　　血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法，先将所有血清IgM(包括异性IgM和非特异性IgM)固定在固相上，在去除IgG后再测定特异性IgM。操作步骤如下：

　　(1)将抗人IgM抗体连接在固相载体上，形成固相抗人IgM。洗涤。

　　(2)加入稀释的血清标本：保温反应后血清中的IgM抗体被固相抗体捕获。洗涤除去其他免疫球蛋白和血清中的杂质成分。

　　(3)加入特异性抗原试剂：它只与固相上的特异性IgM结合。洗涤。

　　(4)加入针对特异性的酶标抗体：使之与结合在固相上的抗原反应结合。洗涤。

　　(5)加底物显色：如有颜色显示，则表示血清标本中的特异性IgM抗体存在，是为阳性反应。

　　(六)应用亲和素和生物素的ELISA

　　ELISA实验原理：ELISA的原理、类型及操作步骤!本生(天津)健康科技有限公司由具有行业背景和丰富市场经验的专业人士组成，于为生命科学研究领域提供产品，为广大科研工作者提供服务。 既能满足研发类客户对产品种类、包装的特殊要求，也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。

　　大鼠Elisa试剂盒操作注意事项与步骤

　　大鼠Elisa试剂盒注意事项:

　　1. 大鼠Elisa试剂盒冻结与寄存：-20℃取出后主张放入2～8℃冰箱中冻结约，每隔一段时间悄悄摇晃均匀，不可直接放入温度较高处冻结，防止因温度改变太大，形成蛋白质凝聚而出现沉积，血清的质量下降。若短期无法用完一瓶，主张无菌分装,再放回冷冻，防止反复冻融。4℃长时间保存后血清中的变性脂蛋白及纤维蛋白，形成絮状物质变差。

　　2. 大鼠Elisa试剂盒是否灭活：加热可灭huoxue清中补体系统，在极少数情况下(培育ES细胞，滑润肌细胞时)主张灭活，在培育其余细胞时不主张灭huoxue清。血清灭活十分简单产生沉积，如必须灭活请按56℃，30 min，轻微摇晃准则操作，灭活温度高、时间长、摇晃不均都简单产生沉积。

　　3. 大鼠Elisa试剂盒培育基：无血清培育基在结果重复性、细胞体外分化方面有优势，可是，血清仍然是培育液中最根本的添加物，尤其是在原代培育或细胞成长状况不良时，常常会先使用有血清的培育液进行培育，待细胞成长旺盛后再换成无血清培育液。

　　大鼠Elisa试剂盒操作过程 ：

　　1.用盖片镊人Elisa试剂盒将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭洁净，不要用纱布;

　　2.将盖玻片悄悄放入6孔培育板(每孔一片)或培育皿中(每个平皿可放置2-3片);

　　3.在间隔紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时;

　　4.将通过计数的细胞悬浮液移入培育板中，使盖玻片彻底浸在培育液中;

　　5.将人Elisa试剂盒培育板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞成长至覆盖培育板底部2/3面积时，将培育板取出，用盖片镊悄悄取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。

　　大鼠Elisa试剂盒操作注意事项与步骤先和大家介绍到这，如果想要了解更多Elisa试剂盒的信息，可以关注天津本生，本生给生物医药客户提供生物实验室检测试剂及耗材，欢迎广大客户来询。

　　本生阐述：elisa操作步骤说明及注意事项

　　酶联免疫吸附测定enzyme linked immunosorbent assay(简写ELISA)，指将可溶性的抗原或抗体结合到聚苯乙烯等固相载体上，利用抗原抗体结合专一性进行免疫反应的定性和定量检测方法。要知道elisa操作步骤首先我们先了解一下elisa的原理是什么。

　　elisa的原理：

　　①使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性。

　　②使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性， 又保留酶的活性。在测定时，把受检标本(测定其中的抗体或抗原)和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体 上形成的抗原抗体复合物与其他物质分开，结合在固相载体上的酶量与标本中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物， 产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据焰色反应的深浅刊物定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到 很高的敏感度。

　　elisa操作步骤：

　　方法一　用于检测未知抗原的双抗体夹心法:

　　1.　包被：用0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1～10μg/ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液洗3次，每次3分钟。(简称洗涤，下同)。

　　2.　加样：加一定稀释的待检样品0.1ml于上述已包被之反应孔中，置37℃孵育1小时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。

　　3.　加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育0.5～1小时，洗涤。

　　4.　加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的TMB底物溶液0.1ml，37℃10～30分钟。

　　5.　终止反应：于各反应孔中加入2M硫酸0.05ml。

　　6.　结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度越 强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测O·D值：在ELISA检测仪上，于450nm(若以ABTS显色，则 410nm)处，以空白对照孔调零后测各孔O·D值，若大于规定的阴性对照OD值的2.1倍，即为阳性。

　　方法二　用于检测未知抗体的间接法：

　　用包被缓冲液将已知抗原稀释至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃过夜。次日 洗涤3次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml于上述已包被之反应孔中,置37℃孵育1小时,洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔 中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育30-60分钟，洗涤,最后一遍用DDW洗涤。其余步骤同“双抗体

　　以上是elisa操作步骤，那么在elisa操作步骤的操作步骤中需要注意什么呢?下面是elisa实验的注意事项：

　　1.正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份，以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或BSA等封闭。

　　2.在elisa操作步骤中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括：固相载体的选择、包被抗体(或抗原)的选择、酶标记抗体工作浓度的选择、酶的底物及供氢体的选择

　　elisa试剂盒 本生(天津)健康科技有限公司是一家从事健康科技技术开发销售的公司，本生生物公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准。本生(天津)健康科技有限公司由具有行业背景和丰富市场经验的业人士组成，于为生命科学研究域提供产品，为广大科研工作者提供服务。 既能满足研发类客户对产品种类、包装的特殊要求，也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。

　　大鼠17-β-雌二醇ELISA试剂盒的实验步骤

　　大鼠17-β-雌二醇试剂盒操作步骤：

　　3. 温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

　　4. 配液：将30(48T的20倍)倍浓缩洗涤液用蒸馏水30(48T的20倍)倍稀释后备用。

　　5. 洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

　　6. 加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

　　注意要点：请仔细阅读产品的详细使用说明,严格遵照规定操作,必能得出准确的结果.

　　操作注意事项

　　1. 试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。

　　2. 实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。

　　3. 不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。

　　4. 使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。

　　5. 使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。

　　6. 洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。

　　7. 底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。

　　8. 加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。

　　9. 按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。

　　Elisa试剂盒 本生一直视质量控制为企业的生命，追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准，以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场，较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢，是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。

　　进口ELISA试剂盒基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性，酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性，又保留酶的活性。在测定时，受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。再加入酶标记的抗原或抗体，也通过反应而结合在固相载体上。此时固相上的酶量与标本中受检物质的量呈一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，故可根据呈色的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化效率很高，间接地放大了免疫反应的结果，使测定方法达到很高的敏感度。

　　进口ELISA试剂盒操作步骤:

　　1.从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条，未用的板条和干燥剂请放回铝箔袋内压 实自封条，密封口袋，放回4℃。

　　2.空白孔加标准品和标本稀释液，其余相应孔中加标本或不同浓度标准品(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育90分钟。

　　3.提20分钟准备生物素化抗体工作液。

　　4.洗板5次。

　　5.空白孔加生物素化抗体稀释液，其余孔加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱孵育60分钟。

　　6.提20分钟准备酶结合物工作液。避光室温(22-25 ) ℃ 放置。

　　7.洗板5次。

　　8.空白孔加酶结合物稀释液，其余孔加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用新封板胶纸封住反应孔，36℃孵箱，避光孵育30分钟。

　　9.打开酶标仪电源，预热，设置好检测程序。

　　10.洗板5次。

　　11.加入显色底物(TMB)100ul/孔，避光36℃孵箱，避光孵育15分钟。

　　12.加入终止液100ul/孔, 混匀后即刻测量OD450值(3分钟内)。在仪器保存读数结果并打印一份纸质结果。

　　13.进口ELISA试剂盒实验完毕后将未用完的试剂按规定的保存温度放回电冰箱保存至有效期结束。 建议保存酶标板框，以备下次或者后试验使用。

　　新手必须知道的Elisa的实验步骤！先和大家介绍到这，如果想要了解更多Elisa试剂盒的信息，可以关注天津本生，本生给生物医药客户提供生物实验室检测试剂及耗材，欢迎广大客户来询。

　　注意操作大鼠Elisa试剂盒事项与步骤

　　大鼠Elisa试剂盒注意事项:

　　1. 大鼠Elisa试剂盒冻结与寄存：-20℃取出后主张放入2～8℃冰箱中冻结约，每隔一段时间悄悄摇晃均匀，不可直接放入温度较高处冻结，防止因温度改变太大，形成蛋白质凝聚而出现沉积，血清的质量下降。若短期无法用完一瓶，主张无菌分装,再放回冷冻，防止反复冻融。4℃长时间保存后血清中的变性脂蛋白及纤维蛋白，形成絮状物质变差。

　　2. 大鼠Elisa试剂盒是否灭活：加热可灭HX清中补体系统，在极少数情况下(培育ES细胞，滑润肌细胞时)主张灭活，在培育其余细胞时不主张灭HX清。血清灭活十分简单产生沉积，如必须灭活请按56℃，30 min，轻微摇晃准则操作，灭活温度高、时间长、摇晃不均都简单产生沉积。

　　3. 大鼠Elisa试剂盒培育基：无血清培育基在结果重复性、细胞体外分化方面有优势，可是，血清仍然是培育液中最根本的添加物，尤其是在原代培育或细胞成长状况不良时，常常会先使用有血清的培育液进行培育，待细胞成长旺盛后再换成无血清培育液。

　　大鼠Elisa试剂盒操作过程 ：

　　1.用盖片镊人Elisa试剂盒将盖玻片自75%乙醇中取出，用无菌丝绸布擦拭洁净，不要用纱布;

　　2.将盖玻片悄悄放入6孔培育板(每孔一片)或培育皿中(每个平皿可放置2-3片);

　　3.在间隔紫外灯直射范围内20-30 厘米处照射2-3小时;

　　4.将通过计数的细胞悬浮液移入培育板中，使盖玻片彻底浸在培育液中;

　　5.将人Elisa试剂盒培育板在5% CO2水浴孵箱中37℃孵育2-3天，当贴壁细胞成长至覆盖培育板底部2/3面积时，将培育板取出，用盖片镊悄悄取出盖玻片，用蒸馏水漂洗后即可进行快速固定以及免疫细胞化学检测。

　　注意操作大鼠Elisa试剂盒事项与步骤，先和大家介绍到这，如果想要了解更多Elisa试剂盒的信息，可以关注天津本生，本生生物给医药客户提供生物实验室检测试剂及耗材，欢迎广大客户来询。

 小鼠促肾上腺皮质激素释放因子ELISA试剂盒操作步骤

小鼠促肾上腺皮质激素释放因子ELISA试剂盒操作步骤，我司由具有行业背景和丰富市场经验的业人士组成，于为生命科学研究域提供产品，为广大科研工作者提供服务。 既能满足研发类客户对产品种类、包装的特殊要求，也能满足生产型企业从小试、中试到规模化生产各个阶段的综合需求。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。

　　ELISA各个操作步骤的注意要点，珠式、管式及磁性球ELSIA，国外试剂均与特殊仪器配合应用，两者均有详细的使用说明，严格遵照规定操作，必能得出准确的结果。

　　一、标本的采取和保存

　　可用作ELISA测定的标本十分广泛，体液(如血清)、分泌物(唾液)和排泄物(如尿液、粪便)等均可作标本以测定其中某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定(如血清、尿液)，有些则需经预处理(如粪便和某些分泌物)。大部分ELISA检测均以血清为标本。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂，而血清标本只要待血清自然凝固、收缩后即可取得。除特殊情况外，在医学检验中均以血清作为检测标本。在ELISA中血浆和血清可同等应用。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为标记的ELISA测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。

　　血清标本宜在新鲜时检测。如有细菌污染，菌体中可能含有内源性HRP，也会产生假阳性反应。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，在间接法ELISA中可使本底加深。一般说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超过一周测定的需低温冰存。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，应充分混匀宜轻缓，避免气泡，可上下颠倒混和，不要在混匀器上强烈振荡。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检测。反复冻融会使抗体效价跌落，所以测抗体的血清标本如需保存作多次检测，宜少量分装冰存。保存血清自采集时就应注意无菌操作，也可加入适当防腐剂。

　　二、试剂的准备

　　按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。ELISA中用的蒸馏水或去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的。自配的缓冲液应用pH计测量较正。从冰箱中取出的试验用试剂应待温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。

　　三、加样

　　在ELISA中一般有3次加样步聚，即加标本，加酶结合物，加底物。加样时应将所加物加在LEISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可溅出，不可产生气泡。加标本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。每次加标本应更换吸嘴，以免发生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加样。有此测定(如间接法ELISA)需用稀释的血清，可在试管中按规定的稀释度稀释后再加样。也可在板孔中加入稀释液，再在其中加入血清标本，然后在微型震荡器上震荡1分钟以保证混和。加酶结合物应用液和底物应用液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。

　　四、保温

　　在ELISA中一般有两次抗原抗体反应，即加标本和加酶结合物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为温育(incubation)，有人称之为孵育，在ELISA中似不恰当。

　　ELISA属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的标本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的终点。在其后加入的酶标记抗体与固相抗原的结合也同样如此。这就是为什么ELISA反应总是需要一定时间的温育。

　　温育常采用的温度有43℃、37℃、室温和4℃(冰箱温度)等。37℃是实验室中常用的保温温度，也是大多数抗原抗体结合的合适温度。在建立ELISA方法作反应动力学研究时，实验表明，两次抗原抗体反应一般在37℃经1-2小时，产物的生成可达。为加速反应，可提高反应的温度，有些试验在43℃进行，但不宜采用更高的温度。抗原抗体反应4℃更为彻底，在放射免疫测定中多使反应在冰箱中过夜，以形成最多的沉淀。但因所需时间太长，在ELISA中一般不予采用。

　　保温的方式除有的ELISA仪器附有特制的电热块外，一般均采用水浴，可将ELISA板置于水浴箱中，ELISA板底应贴着水面，使温度迅速平衡。为避免蒸发，板上应加盖，也可用塑料贴封纸或保鲜膜覆盖板孔，此时可让反应板漂浮在水面上。若用保温箱，ELISA板应放在湿盒内，湿盒要选用传热性良好的材料如金属等，在盒底垫湿的纱布，将ELISA板放在湿纱布上。湿盒应先放在保温箱中预温至规定的温度，特别是在气温较低的时候更应如此。无论是水浴还是湿盒温育，反应板均不宜叠放，以保证各板的温度都能迅速平衡。室温温育的反应，操作时的室温应严格限制在规定的范围内，标准室温温度是指20-25℃，但具体操作时可根据说明书的要求控制温育。室温温育时，ELISA板只要平置于操作台上即可。应注意温育的温度和时间应按规定力求准确。为保证这一点，一个人操作时，一次不宜多于两块板同时测定。

　　本生教您如何选择ELISA试剂盒的正确步骤

　　ELISA试剂盒以灵敏度较高、特异性较好的特点在上得到了广泛的应用，然而实验新手们面对各种各样、动则上上千种的ELISA试剂盒，内心应该是崩溃的。

　　各种厂家、品牌，各种种属，各种因子，琳琅满目，质量良莠不齐，如何浪里淘金，选择既符合研究需求，又品质上乘的 ELISA 试剂盒呢?

　　本生技术小编教你几招，一眼“相中”、最合适的那个ELISA试剂盒!

　　首先，你要明确研究种属：

　　一般来说，厂家都会在产品名称上标明种属，且为单词，检索种属的常用语言为英文。

　　如果您需对不同物种的同一因子进行定量，建议优先寻找适用于多个种属的 ELISA 试剂盒，产品介绍中会注明

　　其次，要明确样本类型：

　　不同厂家验证样本类型不同，即使同一厂家不同试剂盒，其验证样本类型也不尽相同。特别是复杂的血浆样本，根据样本处理方式的差异，分为 EDTA 血浆、肝素抗凝血浆和柠檬酸盐血浆，因此购买前需仔细核对。

　　第三步：要会预测自己的目标因子的浓度

　　一般来说，待测因子可以根据经验或资料获得参考的检测范围，且正常人与疾病状态存在差异。如热门炎症因子 IL-6，正常人血清中浓度为 3.13 pg/mL，病人会显著，CAR-T 回输病人血清中的 IL-6 浓度甚至为正常人的 200 倍以上。

　　因而，必要时进行样本的稀释及选择合适检测范围的试剂盒极其重要。

　　若浓度太低，可选择高敏试剂盒;若不确定待测浓度或样本间浓度差异较大，建议使用检测动态范围更宽的化学发光法ELISA试剂盒。

　　如同样为 IL-6 ELISA 试剂盒，各类型检测范围差异较大，需要根据实际情况选择合适的试剂盒。

　　第四步：检查试剂盒进行过哪些质控

　　质控数据在说明书中即可找到，在购买前检查试剂盒是否进行过严格的质控实验，包括批次内(Intra-Assay)及批次间(Inter-Assay)、掺入回收实验、线性稀释实验及交叉反应测试等，每个数据都看一下，确保的结果重现性及准确性。

　　第五步：确定需检测的因子数量

　　如果待测因子超过 5 个，且样本量较小时，单因子 ELISA 检测方法并不是选择。

　　建议考虑多因子检测方法，如固相芯片(样本数量一般 5 个以内，检测指标可达上百个)及 Luminex 液相芯片方法 (检测样本多达 80 个，检测指标多达 50 个)或微流控 ELISA 检测系统 Ella。

　　可节约样本及时间成本，也可保证检测结果准确。

　　第六步：预算评估

　　预算往往是大家优先考虑的，实际上，不能够一味讲究产品价格，更需要考虑性价比。生物学是极其严谨的科学，一致性的实验结果是基金、文章等评审过程中的因素，即使低廉的价格，不能够重现结果，也是资源的另一种浪费。

　　本生ELISA检测 本生一直视质量控制为企业的生命，追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准，以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场，较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢，是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。

　　猴白介素4(IL-4)ELISA试剂盒操作步骤及样本处理

　　猴白介素4(IL-4)操作步骤：

　　1.加入50ul标准品(Standards)、血清标本于相应反应板孔中。

　　2.每孔加入100ul酶联物(Conjugate)，轻轻混匀30秒(重要)，室温60分钟。

　　3.洗板：甩尽板内液体，用蒸馏水或者洗涤液(普通洗涤液，自配)洗涤反应板，并去除 水滴(在厚叠吸水纸上拍干);这样反复洗涤5次。

　　4.每孔加入100ul显色液，轻轻混匀10秒，室温20分钟。

　　5.每孔加入50ul终止液(StopSolution)。轻轻混匀30秒;30分钟内在450nm处读OD值。elisa试剂盒

　　样本处理及要求：

　　1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。

　　2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。

　　3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。

　　4.,细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。

　　5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。

　　6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.

　　7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

　　猴白介素4(IL-4)ELISA试剂盒注意事项：

　　1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

　　2.浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

　　3.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

　　4.请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔孔的OD值)，请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定，计算时请乘以总稀释倍数(×n×5)。

　　5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　6.底物请避光保存。

　　7.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.

　　8.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

　　9.本试剂不同批号组分不得混用。

　　10.如与英文说明书有异，以英文说明书为准。

　　猴白介素4(IL-4)ELISA试剂盒操作步骤，本生生物小编就分享到这了，看完本文您就应该有了基本的认识和了解相信大家都明白了吧!总的来说，希望对大家有所帮助。

　　elisa实验：怎么保存ELISA试剂盒?

　　(1)要留心避免出现严峻溶血。血红蛋白中含有血红素基团，其有类似过氧化物的活性，因而，在以HRP为符号酶的ELISA试剂盒测定中，如血清标本中血红蛋白浓度较高，则其就很简单在温育进程中吸附于固相，然后与后边参与的HRP底物反响显色。

　　(2)样本的收集及血清别离中要留心尽量避免细菌污染，一则细菌的成长，其所分泌的一些酶或许会对抗原抗体等蛋白发作分化效果;二则一些细菌的内源性酶如大肠杆菌的β-半乳糖苷酶本身会对用相应酶作符号的测定方法发作非特异性搅扰。

　　(3)血清标本如是以无菌操作别离，则可以在2～8℃下保存一周，ELISA试剂盒如为有菌操作，则建议冰冻保存。样本的长期保存，应在-70℃以下。

　　(4)冰冻保存的血清标本须留心避免因停电等形成的重复冻融。ELISA试剂盒标本的重复冻融所发作的机械剪切力将对标本中的蛋白等分子发作损坏效果，然后引起假阴性效果。此外，冻融标本的混匀亦应留心，不要进行剧烈振动，重复倒置混匀即可。

　　(5)标本在保存中如出现细菌污染所形成的的混浊或絮状物时，应离心沉积后取上清检测。Elisa试验是一种敏感性高，特异性强，重复性好的试验确诊方法。因为其试剂安稳、易保存，操作简洁，效果判断较客观等要素，已广泛应用在免疫学查验的各领域中。ELISA试剂盒是用于体外定性检测人血清或血浆中的抗人类戊型肝炎(HEV)病毒 IgM 抗体ELISA检测。成长环境之中的有用因子和营养成分进行更好的了解，确保这种血清原材料的成长活性和可靠性更高，以更加的品质让这种动物细胞培养的活性得到大幅度的提升;

　　ELISA试剂盒 本生一直视质量控制为企业的生命，追求企业竞争力的不断提升。公司在经营中始终秉承：遵纪守法，严于律己，宽仁以待，敢于承担的企业精神作为标准，以过硬的质量和优良的服务来维护和拓展市场，较大限度的满足客户的需求。与客户的共赢，是我们的发展目标。本生!您信任的合作伙伴。我们愿与您真诚合作，共创美好的未来。

　　ELISA实验操作要点：ELISA检测做好这7步需谨慎

　　ELISA检测系统可谓是免疫学反应应用到科研生产中为广泛为灵敏的技术手段。可是在新老手操作过程中总是会出现或大或小的问题，比如说花板，假阳性，全显色，全部显色，显色比空白还低。天津本生为您总结7步ELISA检测实验经验，做好这7步您就能得出的实验结果。

　　1、包被原的性质很重要，蛋白浓度，是否降解，这关系到你做出的抗体可不可以被其识别，所以保存抗原很重要，我做重组蛋白时，师兄都严格警告我一定要在冰浴下缓慢融化就是这个道理。还有有的包被原可能不是蛋白，对于生物素和脂类物质或小分子物质我们要事先对其改造再加以包被，方法简要的列出如下:

　　①亲和素生物素:先亲和素先包被载体，加入生物素化的DNA，这种包被方法均匀、牢固，已扩大应用于各种抗原物质的定量测定。

　　②脂类物质:可将其在有机溶剂(例如乙醇)中溶解后加入ELISA板孔中，开盖置冰箱过夜或冷风吹干，待酒精挥发后，让脂质自然干固在固相表面。

　　③小分子必须依靠和大的蛋白载体偶联后才能固定在固相载体上。

　　2、包被液的选择，一般选择ph9.6的碳酸盐缓冲液。但有时由于试验的需要，包被原的特殊性也可能采用中性的缓冲溶液来包。应注意以下原理：由于蛋白质与聚苯乙/烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用，这种物理吸附是非特异性的，受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响，大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。具体的试验还要有坚固的理论外也要实践，看一下终可不可以应用到自己试验当中去。常用的包被液除了刚才提到的pH9.6碳酸盐缓冲液，还有pH7.2的磷酸盐缓冲液和pH7-8的Tris-HCL缓冲液等等。

　　3、封闭：继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附。常用封闭剂有：0.05%-0.5%的BSA;10%的小牛血清或1%明胶;脱脂奶粉，比较价廉，可以高浓度使用(5%-10%);还有一些稀有用到的各种动物血清(主要为了排除相似蛋白干扰)和酪蛋白等等。但终选用什么，要依据试验具体来实践。

　　4、洗涤板：可以说在ELISA操作中，洗涤是主要的关键技术。因为聚苯乙/烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，为达到分离游离的和结合的酶标记物的目的，清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质，在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。所以在洗板时会有一定误差，人为因素很大(当然有条件的用洗板机除外)，洗的不彻底或串了孔，对如此灵敏的ELISA系统可是不小的影响。

　　5、加抗体标本(和二抗):注意该换枪头时换枪头。标本稀释一般可用PBS稀释，也可用封闭液去稀释。如需加二抗，还要注意二抗的工作浓度，太高浪费，太低则着色浅。

　　6、显色：显色系统又很多，我们一开始做的时候，要选择适宜的显色系统。注意显色系统酶活性底物的保存HRP结合物加硫柳泵，AP结合物可加叠氮钠。

　　7、每次做尽量要把阴阳空三个对照做好，如出现问题也好分析。

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