新推出的ibidi Stage Top Incubators – Silver Line加热孵育系统|活细胞成像实验的理想解决方案

　　您是否正在计划进行活细胞成像实验？您想以最高质量获得令人惊叹的延时图像吗？新的ibidi Stage Top Incubators – Silver Line活细胞工作站是您的理想解决方案。

　　优势：

　　Universal Fit：易于安装在倒置显微镜上

　　出色的成像：带有xyz稳定性的高端显微镜

　　精确控制：由于改进的动态湿度调节，无蒸发或冷凝

　　由德国设计和制造

　　物镜加热器 Objective Heater

　　防止样品冷却：在高分辨率活细胞成像期间（例如，使用油或水浸泡）保持样品确定和稳定的温度

　　技术特点：

　　具有可控的温度、湿度、CO2/O2 ，用于倒置显微镜上进行长期活细胞成像的stage top孵育系统

　　易于安装在每个带有多孔板支架的倒置显微镜上

　　由于连续电流的热调节（最小温度/z-position波动），显微成像期间的最高聚焦稳定性

　　由于加热板的夹紧机构，显微镜载物台上的xy稳定性最高

　　通过动态、湿度控制的反馈调节（ibidi 的专利湿度控制）以及在样品旁进行的精确测量（集成在加热盖中湿度传感器）来防止在 Incubation Chamber内蒸发

　　还提供用于缺氧和耗氧实验的 CO2和 O2控制：ibidi Stage Top Incubator Slide/Dish, CO2 /O2 – Silver Line

　　由于最佳的热量分布，在Incubation Chamber的加热盖上无干扰冷凝的精美图像

　　与ibidi Objective Heater Universal（需另购）一起使用时，适用于高分辨率油浸显微镜

　　适用于微分干涉对比 (DIC) 显微镜和 TIRF

　　含带leveling option的载玻片支架，可用于腔室载玻片、通道载玻片和盖玻片，以及所有 ibidi µ-Slides（详见操作说明）

　　含带leveling option的培养皿支架，可用于具有不同壁高的35 mm dishes培养皿，µ-Dish 35mm，high 和µ-Dish 35mm, Low

　　含外部温度传感器（如：用于在系统校准期间测量样品的温度）

　　准确稳定的CO2和O2气体孵育

　　使用加压气体产生气流（无振动）

　　提供可选的气压发生器（当无法获得加压空气时）

　　减少电缆数量，易于操作

　　含用于远程控制和数据记录的 IncuControl 软件

　　应用：

　　1、 ibidi Stage Top Incubators – Silver Line加热孵育系统非常适合需要显微镜生理条件的活细胞成像实验。

　　结合ibidi气体控制系统和ibidi加热系统，可以精准控制显微镜上的温度、湿度和CO2/O2水平等基本参数，以获得可重复的结果，比如：

　　趋化性实验

　　血管生成实验

　　细胞迁移实验

　　伤口愈合实验

　　增殖实验

　　流动检测下的细胞培养

　　缺氧和耗氧实验（仅限ibidi Stage Top Incubator Slide/Dish，CO2 /O2 – Silver Line）

　　2、 ibidi Stage Top Incubators – Silver Line加热孵育系统针对需要额外聚焦稳定性的高分辨率成像应用进行了优化，比如：

　　TIRF

　　荧光显微镜

　　共聚焦显微镜

　　DIC显微镜

　　油浸显微镜

　　ibidi Stage Top Incubators – Silver Line 加热孵育系统工作原理

　　细胞对环境的变化做出敏感的反应。温度、湿度/蒸发和 CO2 /O2水平等因素显着影响细胞培养实验的结果。因此，在活细胞成像实验期间保持显微镜载物台上的最佳条件以实现生物学相关和可重复的结果至关重要。

　　 ibidi Stage Top Incubators – Silver Line 加热孵育系统结合了ibidi Heating System – Silver Line加热系统和 ibidi Gas Incubation System – Silver Line气体控制系统。

　　ibidi加热系统为高分辨率活细胞显微镜创造稳定和均匀的温度。适用于多孔板的通用安装框架的倒置显微镜载物台。当放置在ibidi加热Chamber中时，在显微镜上进行活细胞成像实验期间，细胞培养容器将保持稳定、确定的温度。

　　ibidi气体控制系统为像ibidi加热系统的stage top孵育系统提供湿润且富含CO2的空气。气体混合物通过stage top孵育系统连续冲洗，确保碳酸氢盐缓冲液的最大湿度和最佳pH值。

　　对于缺氧实验， ibidi Stage Top Incubators, CO2/O2 – Silver Line加热孵育系统可以精确控制细胞培养容器中的氧气水平。周围O2水平可以控制在1%~21%的范围内，很容易适应实验要求。

　　订购信息：

　　细胞生物学是生命科学的一门学科。顾名思义，它致力于研究生物。单凭这一事实就足以成为研究细胞自然生存状态的理由。当然，活细胞成像还有其他深层次的原因。在本篇文章中，我们列举了用延时显微镜研究活细胞是有意义的五大很好的理由。

　　背景

　　活细胞成像允许在一定时间内在显微镜下对细胞进行体内观察。各种显微镜技术适用于活细胞成像：例如，可以采用无标记的技术，如相差，DIC，或干涉测量法，也可以依靠荧光显微镜，利用荧光标记标记和可视化细胞亚结构、分子或蛋白质。当然，活细胞成像也面临挑战，在建立活细胞图像实验时需要考虑某些要求。最重要的是，必须确保显微镜配备了一个stage top 培养箱，能够提供理想的环境，使细胞在一段时间内保持存活和健康。

图1.A：活细胞成像过程中需要考虑和控制的环境参数

图1.B：倒置显微镜的台顶培养箱示意图

　　参数和环境条件是此类实验的重要部分，我们将在以后的公众号中讨论。如果您有兴趣，可以在本篇文章中查看更多相关内容。在此我们已经介绍了基本知识，接下来我们将继续深入探讨为什么您应该使用活细胞成像来研究您的细胞：

　　1.避免固定过程中的人工制品

　　细胞通常在显微镜观察前固定（如免疫荧光），以保存在逼真的状态。多年来，许多不同的化学和物理程序已被优化和建立，以保持原始样品的质量。然而，固定过程会对细胞造成损害（当然在这个过程之后，它们会死亡），并不可逆转地改变其组织、结构和形态（细胞器收缩、蛋白质定位错误等）。然而，活细胞成像可以让我们研究活细胞。这意味着他们应该展示他们的自然形态，这仍然会受到荧光标签、激光等的影响，但这就像环境条件一样，是一个不同的状况。

　　2.观察和分析动态过程

　　活细胞成像使我们能够观察整个细胞群、单个细胞甚至亚细胞水平的动态事件。当固定细胞将其锁定在特定时间点的特定（行为或结构）状态时，对活细胞的显微镜观察可以洞察整个动态过程。基于功能性细胞的检测，如损伤和迁移（图2）或趋化实验是活细胞成像应用的很好的例子。这些分析使得研究细胞对化学（趋化性）或机械（伤口愈合）刺激的反应成为可能。

图2：使用ibidi Stage Top孵育系统的活细胞成像显示了伤口愈合和迁移试验中MCF7细胞的间隙闭合。相差；10倍物镜。

　　3.实时跟踪细胞变化

　　活细胞显微镜是实时了解细胞随时空变化的一种有价值的方法，而不是依赖于固定细胞的端点的分析结果。通过使用延时视频显微镜对细胞进行更长时间的跟踪，可以捕捉到结构重排的动态(如图3，感受趋化刺激后细胞骨架的极化), 或使用固定细胞可能会错过的瞬时细胞性活动(如，有丝分裂期间的染色体分离)。

图3：应用趋化梯度后，表达LifeAct的原代树突状小鼠细胞中肌动蛋白动力学的活细胞成像

　　4. 研究单分子动力学、定位和相互作用

　　先进荧光标记和成像技术的发展，如光脱色荧光恢复技术（FRAP）、荧光寿命成像显微技术（FLIM）和荧光共振能量转移技术（FRET），使活细胞成像过程中单分子定位、动力学和相互作用的观察和分析成为可能。

　　FRAP可以测量活细胞内荧光标记分子和蛋白质的迁移率。FLIM通过测量附着的荧光团的寿命来提供有关细胞分子分布及其环境的信息。

　　利用FRET，人们可以通过检测两个分子在纳米级相互接近时所附荧光团的相互作用来测量活细胞中两个分子的直接相互作用。

　　5. 从单个实验中获取更多信息

　　总的来说，如果您进行活细胞成像，您可以从单个实验中获得比从固定细胞成像更多的信息。这是因为活细胞成像使人们能够跟踪分子动力学和动力学，并提供了您感兴趣的一个更大、更全面的细胞过程图像。

　　对固定样本的分析通常只提供某个细胞性活动的快照，而跟踪整个动态过程使人们能够从单个实验中测量更多参数，并得出更多不同的结论。

　　如您有兴趣了解更多关于活细胞成像的知识，请关注我们公众号活细胞成像应用相关内容。也可以向我们索要相关资料。

　　活细胞成像应用相关内容：

•  什么是活细胞成像？  

活细胞成像(live cell imaging)统称为捕捉活的、活动状态的细胞图像的技术，这些细胞图像可以是单个静态图像，也可以是延时系列图像。相应地，活细胞成像的应用可以分为两大类：

❶ 细胞在自然状态下的图像记录。

❷ 实时观察和记录细胞、组织或整个生物体的动态过程。

•  观察分析活细胞时面临的挑战  

▷ 在相对较短的时间内采集大量信息。

▷ 要保持细胞保存在可调节培养环境气体浓度和温度（在很多情况下）的培养室中。

▷ 激发光源会损害活细胞。

▷ 细胞焦面漂移，无法聚焦。

▷ 需要使用配备有软件或硬件控制自动对焦的成像仪器来避免这种情况。

Revolution全自动显微镜成像系统

Revolution全自动显微镜成像系统部件高度集成内置，节省空间，避免繁琐调试及维护；触屏式操控观察工作站，界面直观简洁，易于学习，方便使用。Revolution全自动显微镜成像系统的光源采用高能LED光源，自动荧光切换把光毒降低。

▌智能化全自动多功能系统：

▶ TimeLapse延时摄影：可以根据设定在特定时间内完成特定间隔时间和特定的拍照张数。

▶ 独有的Hyperscan快速成像：30帧高速成像，可以在几秒钟内完成上百张照片的采集。

▶ Multi-well Point孔板导航成像：不限定孔位大小，只需输入参数就可以自动完成多孔或单孔采集。

▶ Focus Map自定义多点聚焦：可以自动完成不同层面的自动聚焦。

▶ Z-Stacking多层扫描大景深成像：完成多层面大景深成像。

▶ DHR智能实时数字化降噪：实时完成反卷积计算，得到清晰图像。

▌ECHO INCUBATOR为活细胞观察提供一个稳定而灵活的培养环境

ECHO INCUBATOR采用紧凑的一体式设计，方便用户快速安装和拆卸。箱体结构透明和大型前置开门设计，可为用户提供清晰的观察视野并方便操作样本。采用无风扇对流加热和循环热空气方案，在消除振动的同时并可防止外部灰尘进入您的样品和仪器光学元件。提供稳定的细胞生长环境，确保适合的细胞培养条件，使细胞处于zuijia生长状态。

利用微流控技术在微流控芯片通道内进行实时的细胞培养对很多生物学、医学等领域的工作人员来讲是一个重大的挑战和机会，通过该技术可以大规模的降低实验耗材消耗，提高实验转化效率，模拟实际生物环境下的细胞生长行为等。在科学研究和工业应用中，活细胞成像的细胞培养都具有较大的应用前途，那么现在有没有一款或一套合适的仪器来做细胞培养实验呢？答案是有的，Elveflow微流控灌注套装（Perfusion Pack）结合ALine公司的Microslides便可以完成细胞培养实验。

ADHERENT MAMMALIAN CELLS

YEASTS

WORM EMBRYOS

1、Culture-Inserts插件可以重复使用吗？

尽管 Culture-Inserts 插件中的材料可高压灭菌并且与酒精相容，但我们不建议重复使用。 如果您仍想尝试重复使用，则需要建立一个用酸或碱的清洁程序。 ibidi没有任何清洁Culture-Inserts插件的经验，虽然它们可能会保持粘性，但之前实验的残留可能会影响重现性。 

2、可否在盖玻片上使用 Culture-Inserts插件吗？

可以，您可以在任何盖玻片上使用 Culture-Inserts插件。 到目前为止，还没被报告与任何干燥表面不相容。 

3、是否可以使用 Culture-Insert 插件制作小于 500 µm 的伤口？

图片

不可以，Culture-Inserts 插件中最小和标准的伤口尺寸是 500 µm。 Culture-Insert 4 Well /4孔插件会有一个额外的中心间隙，伤口大小为 1000 µm。

3的图片

4、Culture-Insert 插件是如何固定在培养皿上的？

Culture-Insert 插件由生物相容的硅胶材料制成。 硅胶底部有一个粘性表面，可粘附（粘）在任何平坦、干燥、均匀的表面。 这种材料足够柔软可粘到表面上。 您可以用无菌镊子按压插件来简单地修复它。

4的图片

 5、您是否曾经遇到过 Culture-Inserts 插件无法粘附在定制涂层表面上的问题？

只要表面干燥，我们从未遇到过让 Culture-Inserts 插件粘附在定制涂层表面上的任何问题。 但是，潮湿的表面会导致泄漏。 因此，请确保您的定制涂层表面完全干燥。

6、需要在 Culture-Insert 插件中播种多少个细胞才能进行细胞迁移实验？

图片

开始迁移实验时，Culture-Insert 插件中的细胞层应融合。 在所有实验中，汇合细胞层的密度应尽可能一致。 使用的接种细胞数量取决于您的细胞类型，因此您可以在 Culture-Insert 2 Well 说明书中找到推荐的范围和详细方案。 

7、为什么移除 ibidi Culture-Insert 插件后细胞有时会从盖玻片上脱落？

以下是解释细胞脱离的一些可能原因：

• 细胞密度太高。 --> 播种更少的细胞（细胞层应在 24 小时后生长至 100% 融合，但不能过度生长）。有关伤口愈合试验的详细方案，请参阅：伤口愈合／细胞划痕实验新方法－如何划出笔直均一的划痕（这是个链接2020-12-10发布的公众号）

• 细胞正在挨饿。 --> 增加每个插入孔的培养基体积，或在细胞生长期间更换培养基。

• 在极少数情况下，细胞类型不能很好地粘附在 ibiTreat 表面。 --> 首先，覆盖盖玻片表面以促进细胞附着。然后，在插入 ibidi Culture-Insert 插件之前让涂层干燥。

以下是使用带有涂层的 ibidi Culture-Inserts 插件以促进细胞粘附的一些额外提示：

• 我们强烈建议提前测试移除ibidi Culture-Insert 插件是否会破坏迁移间隙中的涂层。这可以通过使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体进行分析。如果迁移间隙区域中涂层的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，则可以假设在插入物移除后是保持完好的。经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

• 如果去除插入物破坏了大部分涂层，则仅涂覆插件的孔，然后接种细胞。取出插件后，通过向培养基中添加低浓度涂层来填充间隙并孵育约 30 分钟。之后，用普通介质替换涂层溶液并继续进行迁移实验。

7的图片

8、当 Culture-Insert变干燥时，包被蛋白会失去活性吗？

这主要取决于与 Culture-Insert 插件一起使用的蛋白质类型。 使用层粘连蛋白的人通常更喜欢在涂层和细胞接种之间保持水分。 根据我们的经验，当纤连蛋白和胶原蛋白 IV 干燥时，我们没有发现对细胞迁移速度有任何影响。 

9、有没有办法用悬液细胞进行伤口愈合实验，或者该实验仅适用于贴壁细胞？

目前，使用 Culture-Insert插件的伤口愈合实验只能用于贴壁细胞。 然而，单个细胞的迁移研究可以在 µ-Slide 趋化性中通过将细胞嵌入到3D基质（例如，I 型胶原蛋白凝胶）中进行。 

10、是什么使 Culture-Inserts插件在细胞接种过程中不会泄漏？

Culture-Insert 插件由硅胶材料制成。 上部是粗料，下部是非常柔软的材料，在按下 Culture-Insert 插件后会固定在表面上。 正确插入时是不会有任何泄漏的。 

11、该如何存储 Culture-Inserts插件？

请在室温下储存 Culture-Inserts。 打开过的产品应储存在无菌容器中。 

12、有时很难在 Culture-Insert 插件中看到细胞层的汇合。 您有什么建议？

当使用相差显微镜和小孔时，例如 Culture-Insert 插件或 96 孔板，空气-水界面之间的弯月面会导致表面强烈弯曲。 这会破坏除孔中心以外的任何地方的相位对比效应。

一种解决方案是用细胞培养基完全均匀地填充 Culture-Insert 的两个孔。 通过这样做，您可以在孔上方的介质和空气之间创建一个平面。 请记住，这可能会导致两孔之间的交叉污染。

13、有时，细胞倾向于聚集在 ibidi Culture-Insert插件的边缘。 怎样才能避免这种情况？

当细胞在 Culture-Insert插件中生长到非常高的密度时，会观察到了这种情况。 为了减少细胞团块，您应该在实验开始时使用较低的细胞密度。 然而，有时细胞会粘在与细胞相容的硅胶上。 在这种情况下，我们建议较少孵育时间和/或细胞数量。 

14、Culture-Insert 如何在不造成细胞损伤的情况下模拟生理伤口？

图片

使用体外实验时，很难以可重复的方式模拟生理伤口。 当然，来自死细胞的碎片可能在与伤口愈合相关的迁移中发挥作用。 使用 Culture-Insert插件的 ibidi 伤口愈合实验提供了可重复的、无损伤的细胞贴片。

在体内，各种其他参数对伤口愈合的影响更大，例如不同细胞类型的相互作用。 使用 Culture-Insert插件的体外 ibidi 伤口愈合实验将迁移速度与所有这些其他影响分开，提供了一个客观且可重复的实验环境。

15、用Culture-Insert插件产生间隙时细胞是否会受损？

Culture-Insert 插件将细胞彼此分离，而不会产生传统意义上的伤口（例如，在划痕实验期间）。 目的是在不产生大量受伤细胞的情况下产生间隙，然后研究间隙闭合。该技术使用户能够将细胞的迁移行为与细胞损伤区分开来。 

16、 Culture-Inserts 插件能否用于蛋白质涂层表面？ 拔出 Culture-Insert 插件会干扰涂层吗？

一般来说，只要涂层干燥，Culture-Insert 产检可以放置在涂层表面上。 请注意，插件不会黏附在潮湿的表面上。

但是，我们强烈建议您提前测试插件移除是否会破坏迁移间隙中的涂层。 您可以使用针对涂层蛋白的荧光标记抗体来分析这一点。 如果迁移间隙区域的涂层发出的荧光信号与开放孔中的一样均匀和强烈，那么您可以假设在移除插件后涂层是保持完好的。 经过几次成功的测试后进行实际实验通常是安全的。

图片

　　细胞划痕实验（Wound Healing)是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外试验方法。为了研究细胞迁移的机制，科学家们传统上转向“划痕试验”，它利用移液器尖端在多孔板中的单层细胞上“划痕”，并观察间隙所需闭合的时间（这些有时也被称为“伤口闭合”或“伤口愈合”分析）。这种类型的实验允许分析细胞迁移，并可以用各种药物和化学品来增强，以阐明特定的机制。

　　在 ibidi 35mm µ-Dish 中培养的内皮细胞，预置2-Well Culture-Insert。移除插件后，让细胞迁移 24 小时，然后固定在 4% PFA 中，并进行透化。VE-钙粘蛋白（洋红色）、 F-肌动蛋白用鬼笔环肽（绿色）和细胞核用DAPI（蓝色）的抗体染色，然后进行共聚焦成像。

　　Derek Sung, University of Pennsylvania School of Medicine：

　　我一直都有进行划痕分析。与大多数体外测定类似，一致性是获得准确和可重复结果的关键。作为进行过无数次此实验的人，使用移液器手动创建间隙存在一些过去给我带来麻烦的关键问题。这就是为什么发现 ibidi Culture-Inserts是一种救星。ibidi 细胞培养插件与传统的划痕检测方法相比具有许多优势：

　　1. 标准的间隙距离

　　传统划痕分析和使用移液管手动划痕大挑战之一是间隙距离不一致。而且，划痕往往划不直。因此，起始距离通常会在几十到几百微米之间变化。ibidi 的细胞培养插件中心会产生500 µm 无细胞的人造间隙。这确保了间隙是直的，并且每次的距离都是一致的。

　　2. 干净的迁移边缘

　　手动划痕还会产生未完全去除的自由浮动细胞的问题。这些自由漂浮的细胞可以通过延迟自由边缘的迁移、释放细胞内内容物或重新附着来影响迁移率。ibidi 的细胞培养插件是可移除的，留下干净笔直的边缘。

　　3. Z小化细胞数

　　传统的划痕检测是在多孔板中完成的，需要一层汇合的细胞。如果实验有多种条件（药物治疗或基因操作）并且需要多次重复，这会需要增加大量细胞。对于珍贵或昂贵的细胞（例如从难以获得的组织中分离出的原代细胞），这些实验可能变得难以进行。ibidi 的细胞培养插件具有较小的生长面积，可大限度地减少实验所需的细胞数量（准确地说，每孔0.22 cm 2）。这允许大限度地利用宝贵的细胞或增加重复次数。

　　4. 盖玻片底皿

　　划痕分析通常在多孔板中进行，底部厚，聚苯乙烯，只允许明场成像和间隙距离的量化。ibidi 的细胞培养插件具有经过组织培养处理和灭菌的盖玻片底部。这允许进行明场和免疫荧光成像。就我个人而言，我认为这是该产品好的方面，让我们能够看到如细胞骨架、细胞粘附形态、核形态等结构。此外，多模态成像功能大限度地提高了单个实验的数据量，从而节省了成本和试剂。

　　5. 单个实验的独立插件

　　“边缘效应”是指一种细胞培养现象，其中多孔板外周的孔比内孔经历更多的蒸发，导致不同的条件和潜在的不一致结果。使用多孔板进行划痕检测时可以看到类似的效果，影响结果的一致性和重现性。ibidi 的细胞培养插件单独包装，用于单次实验。这可以防止任何“边缘效应”并确保数据一致。另外，培养皿设计有盖子锁定功能，以确保在处理盘子时盖子保持打开状态。

　　与枪头划痕检测相比，ibidi 伤口愈合插件可提供更高的重现性

　　由于细胞迁移开放区域随时间发生变化。使用 ibidi Culture-Insert 2 孔（左）和用移液器吸头刮擦产生间隙的对比。数据来源：德国弗莱堡大学的 M. Börries。

　　乍一看，枪刮和放置插件的方法似乎是两种非常相似的创建无细胞间隙的方法。 然而，仔细观察，这两种方法可能在重要检测结果方面的影响有所不同：

　　小鼠 L929 成纤维细胞的多细胞球体是在µ-Slide 球体灌注中创建的。在从细胞悬浮液中形成球体后，使用 ibidi 泵系统进行灌注。添加 ibidi Pump 可确保球体在长期培养过程中获得最佳营养。

　　在灌注培养 1 周后，将球体固定并用鬼笔环肽染色以观察 F-肌动蛋白细胞骨架。最后，球体被清除以增强成像深度和分辨率。我们使用EMOVI 方法进行具有成本效益、无害的整体成像，这可以在固定球体上实现基于抗体的多重免疫标记。球体的清除允许分析整个球体成纤维细胞甚至在球体成纤维细胞中心的成纤维细胞的分布和组织，同时保留球体的形态

　　01材料和试剂

　　细胞和试剂

　　•L929成纤维细胞（DSMZ，编号ACC 2）

　　•Accutase(A1110501,Gibco)

　　•细胞培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•胎牛血清 (FCS, Gibco, 10270106)

　　•细胞内 (IC) 固定缓冲液 (eBioscience, 00-8222-49)

　　•Dulbecco 磷酸盐缓冲液（PBS、Sigma、D8537）

　　•正常小鼠血清（Jackson，015-000-120）

　　•正常驴血清（Jackson，AB_2337258）

　　•Triton X-100（Alfa Aesar，A16046）

　　•Flash Phalloidin™ Green 488（鬼笔环肽；500x，Thermo Fisher Scientific，46410）

　　•4'，6-二脒-2-苯基吲哚（DAPI，浓度20μg/mL，西格玛奥德里奇，D9542）

　　•去离子水 (diH2O)

　　•异丙醇（Carl Roth，CP41.2）

　　•肉桂酸乙酯 (ECi) (Sigma, W243000)

　　02缓冲液和溶液

　　培养基

　　•新鲜制备并在 4°C下储存长达一周

　　•基础培养基 RPMI-1640 (Gibco, 21875034)

　　•10%  FCS （ Gibco，10270106）

　　封闭和染色缓冲液

　　•PBS 

　　•1% （v/v）FCS 

　　•1% (v/v) 正常小鼠血清

　　•1% (v/v) 正常山羊血清

　　•0.3% (v/v) Triton  X-100

　　染色液

　　•封闭和染色缓冲液

　　•1:500 鬼笔环肽（最终浓度 1x）

　　•1:10 DAPI（最终浓度 2 µg/mL）

　　30% / 50% / 70% (v/v) 异丙醇稀释液

　　•混合适当体积的 diH2O 和异丙醇

　　•使用前预冷至 4 °C

　　03 设备   

　　•ibidi 泵系统 (ibidi, 10902)

　　•具有生物惰性表面钝化的 ibidi µ-Slide 球体灌注（ibidi，80350）

　　•用于 µ-Slide 的 ibidi 串行连接器（ibidi，10830）

　　•ibidi 灌注套装蓝色 (ibidi, 10961)

　　•层流罩

　　•培养箱，37°C 和 5% CO2

　　•血细胞计数器（康宁)

　　•移液器(康宁）

　　•倒置共聚焦显微镜（Leica TCS SP8）

　　•徕卡应用套件 X

　　•LIGHTNING（反卷积软件）

　　•Imaris v9.5

　　04 操作程序

　　第一部分：µ-Slide球体灌注中的球体形成和培养

　　请在使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 之前阅读指示。所有步骤均需在无菌条件下执行。

　　开始实验之前，在标准细胞培养瓶（例如 T75）中制备 L929 成纤维细胞，细胞粘附在底部。细胞在实验当天应该是健康的并且最佳亚汇合。

　　重要提示：在 37°C 和 5% CO2的培养箱内过夜平衡所有必需的材料，例如载玻片、培养基和管道（灌注套件）。平衡对于防止气泡随着时间的推移而出现至关重要。

　　1. 将60 µl 无细胞培养基注入 µ-Slide Spheroid Perfusion 的每个通道（根据说明用提供的盖玻片封闭）

　　2. 在培养箱中 37°C 孵育 2 小时。孵育期间始终关闭盖子。

　　3. 用 Accutase 处理培养的 L929 细胞 1-2 分钟以使其脱离。

　　4. 收集细胞悬液，离心，在培养基中稀释；量取决于所需的细胞浓度。

　　5. 对细胞计数并调整至终浓度为 5 x 105cells/ml。

　　6. 用无细胞培养基冲洗 µ-Slide 球体灌注的通道，以去除潜在的气泡。

　　7. 将 45 µl 细胞悬液直接移入每个通道。

　　8. 在 37°C 下孵育 1 小时，使细胞在壁孔中沉淀。

　　9. 用60 µl 无细胞培养基填充 µ-Slide Spheroid Perfusion 的储液库。

　　10. 在 37°C 下孵育过夜以形成球体。

　　11. 检查通道是否有气泡。如果通道中存在任何气泡，请用无细胞培养基小心冲洗通道。

　　12. 使用ibidi 串行连接器连接 µ-Slide Spheroid Perfusion 的 3 个通道

　　13. 根据ibidi 泵系统、流体单元和灌注装置指示.

　　14. 将µ-Slide 球体灌注连接到 ibidi 泵系统并开始流动。使用尽可能低的流速（5 mBar 气压导致流速为 0.74 ml/min）。进行实验，直到球体具有所需的成熟状态，在这种条件下培养 7 天后。

　　图1：L929 成纤维细胞在孔中形成球体并在流动条件下培养

　　图 2：L929 成纤维细胞在µ-Slide 球体灌注中显示球体形成。第1 天的示例

　　(A)第 6 天 (B)，使用 ibidi 泵系统灌注，0.74 毫升/分钟。相差显微镜，10 倍物镜，井径 800 µm。

　　第二部分：L929 球体的染色和清除

　　染色直接在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中进行。在开始染色之前，请阅读指示并遵循载玻片中关于一般移液和更换溶液的建议。

　　1. 当 L929 球体培养达到所需的成熟状态（此处为 7 天后）时，小心地断开 µ-Slide球体灌注与 ibidi 泵系统的连接。

　　2. 在 RT 处用冷 IC 固定缓冲液固定球体 10 分钟。

　　3. 在 RT 中将球体封闭和染色缓冲液中孵育 1 小时。

　　4. 在 37°C 下用染色溶液孵育球体过夜。从这一点开始，保持载玻片避光。图 3A 显示了清除前的球体成像。

　　5. 第二天，用 Blocking and Staining Buffer 清洗细胞一次。

　　6. 通过在冰上以上升 30%、50% 和 70% 的异丙醇稀释液孵育15 分钟，依次使球体脱水。

　　7.  在冰上用纯异丙醇孵育球体两次 15 分钟。

　　8.  从冰中取出载玻片，让它升温至 RT。

　　9.  执行清除：在 RT 处用纯 ECi 灌注两次。在这个阶段，球体可以避光储存数周，而不会显着损失荧光。

　　10.  使用共聚焦显微镜的图像球体（参见图 3）。

　　图 3：清除前后染色 L929 球体的共聚焦显微镜（红色：鬼笔环肽，青色：DAPI）。

　　(A) 清除前的球体。请注意，由于光散射和吸收，只能看到外围细胞，而看不到中心的细胞。(B, C) 清除后的球体。请注意，清洗前后的尺寸差异源于脱水和清洗过程，同一位置的横截面。(B) 横截面 (C) 体积/3D 视图。球体的清除允许即使在球体成纤维细胞的中心也可以看到细胞，同时保留球体的形态。细胞核的计数甚至可以确定形成该球体的细胞数。

　　点击请查看清除前后染色球体的直接对比视频 (z-stack of 440 slices at a slice spacing of 0.36 µm)。

　　注：此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者E-mail address: selina.keppler@tum.de

　　仅供科研使用！

AnielloFederico*,JochenUtikalSkinCancerUnit,GermanCancerResearchCenter(DKFZ),69120Heidelberg,Germany.*Correspondingauthor.E-mailaddress:a.federico@dkfz-heidelberg.de

为了研究肿瘤微环境影响下肿瘤细胞的运动性和侵袭特性，建立了体外2D侵袭方案。这种2D侵袭方案是一种共培养试验，在这种情况下，是由肿瘤和基质细胞（例如成纤维细胞）组成的。一旦两种细胞类型接触，在不同的条件下评估侵袭成纤维细胞单层的肿瘤细胞的数量，在我们的研究中，我们在模拟实体肿瘤微环境中发现的条件，例如与基质细胞（成纤维细胞）的相互作用以及成纤维细胞释放的可溶性因子（Nnetu等，2012）。我们使用A375黑色素瘤细胞系和真pi成纤维细胞进行了此测定。黑色素瘤细胞激活成纤维细胞，继而维持肿瘤细胞的生长，恶性转化和耐药性（Flach等，2011）。然而，在刺激所测试的抗ai化合物后，我们发现与成纤维细胞直接接触的黑素瘤细胞显示出运动能力受损并且未能侵袭成纤维细胞层。

材料和试剂

1. GFP-A375细胞系（ATCC）

2. 番茄皮成纤维细胞（从健康患者中分离）

3. MEF细胞培养基

4.PBS（Sigma-Aldrich；D8537）

5.胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich；T3924）

6. 台盼蓝溶液（Sigma-Aldrich;93595）

7.DMSO（CarlRoth;A994.2），在0.1％最终浓度下使用

8.MithramycinA（BioTrend；10-2085-5mg），在300nm浓度下使用，用DMSO稀释

仪器设备

1. 层流净化罩

2. 12/24孔多孔板（GreinerBio-One）

3. 台式离心机

4. 细胞计数器

5. 2孔插件（ibidi: 80209）/预置2孔插件培养皿（ibidi:81176）

6.细胞培养管

7. 涡旋

8. 镊子

9. 光学显微镜

10. 荧光显微镜

11. NIS-Elements软件

ibidi:81176

实验流程

01. 将GFP-A375和番茄成纤维细胞系稳定地保存在MEF培养基中，在37°C和5%C02加湿培养箱中。

02. 当细胞达到亚融合度（约80％融合度）时，在带有PBS的通风橱中清洗它们，以去除死细胞和碎片。

03. 在培养箱中用胰蛋白酶-EDTA溶液胰蛋白酶消化细胞约5分钟，然后添加MEF培养基以阻止反应。

04. 将细胞悬浮液收集在15ml细胞培养管中，并用台式离心机（1500xg,5´,RT）短暂离心。

05. 将细胞重新悬浮在新鲜培养基中；将一体积的细胞悬液与另一体积的台盼蓝溶液混合，用细胞计数器计数活细胞。

06. 在MEF缓冲液中以4x105细胞/ml的浓度稀释细胞。

07. 在多孔板上，在每个孔的中间放置一个Culture-Insert2孔（2孔培养插件）。

08. 用75µl（3x104细胞）FP-A375细胞填充插入物一侧，并用番茄成纤维细胞填充另一侧。用移液器上下混合插入物中的细胞，以确保细胞完全分布。

09. 将多孔板放在培养箱中，放置过夜。

10. 第二天，在镊子的帮助下，小心地从每孔中取出培养基和插件，并用PBS清洗。

11. 小心除去PBS，然后加入新鲜的MEF培养基。

12. 用光学显微镜检查GPF-A375与Tomto成纤维细胞之间产生的间隙的闭合状态。

13. 一旦每个孔中的间隙完全闭合，请使用荧光显微镜和成像软件获取荧光图像。确保肿瘤细胞尚未侵入成纤维细胞单层。

14. 小心地除去培养基，并在控制组孔中添加培养基+0.1％PBS，在处理组孔中添加培养基+300nM丝裂霉素A。将板放在培养箱中24小时（处理孵育时间）。

24小时后，在荧光显微镜下重新采集共培养孔，以评估治疗组与对照组（绿色荧光细胞散布在红色标记层上）的肿瘤细胞侵袭行为的任何变化（图2）。

图1：2D侵袭系统的示意图

图2：2D侵袭检测的荧光图像

将黑素瘤细胞和成纤维细胞共培养，然后暴露于300nmMithramycinA（或DMSO）。24小时后，评估侵袭成纤维细胞层的肿瘤细胞的数目。A375细胞显示出大规模的侵袭行为，受到MithramycinA治疗的损害。比例尺：500μm。

备注：

1.此处描述了MEF培养基组成（参考文献1）。

2.此文仅供参考。

3.此实验方案来自ibidi的实际用户，更多详情可联系本文作者。

参考文献：

1.MithramycinAandmithralogEC-8042inhibitSETDB1expressionanditsoncogenicactivityinmalignantmelanoma. FedericoA,SteinfassT,LarribèreL,NovakD,MorísF,NúñezLE,UmanskyV,UtikalJ.MolelucarTherapy-Oncolytics2020;doi: https://doi.org/10.1016/j.omto.2020.06.001 (Methoddescribedinthisprotocolwasincludedinthispublishedarticle).

2.Theimpactofjammingonboundariesofcollectivelymovingweak-interactingcells. NnetuKD,KnorrM,KäsJ,ZinkM.NewJournalofPhysics2012;doi:https://doi.org/10.1088%2F1367-2630%2F14%2F11%2F115012

3.Fibroblastscontributetomelanomatumorgrowthanddrugresistance. FlachEH,RebeccaVW,HerlynM,SmalleyKS,AndersonAR.Molecular pharmaceutics2011;doi:10.1021/mp200421k

利用微流控技术在微流控芯片通道内进行实时的细胞培养对很多生物学、医学等领域的工作人员来讲是一个重大的挑战和机会，通过该技术可以大规模的降低实验耗材消耗，提高实验转化效率，模拟实际生物环境下的细胞生长行为等。在科学研究和工业应用中，活细胞成像的细胞培养都具有较大的应用前途，那么现在有没有一款或一套合适的仪器来做细胞培养实验呢？答案是有的，Elveflow微流控灌注套装（Perfusion Pack）结合ALine公司的Microslides便可以完成细胞培养实验。

　　免疫荧光实验原理

　　免疫荧光(IF)是使用显微镜深入了解细胞结构和过程的有效方法。此方法可评估特定蛋白质的表达和位置，使得免疫荧光成为科学家解决许多细胞生物学问题不可或缺的工具。

　　免疫荧光实验基于以下主要步骤：

　　1.特异性抗体与感兴趣的蛋白质结合。

　　2.荧光染料与这些免疫复合物偶联，以便使用显微镜观察感兴趣的蛋白质。

　　内皮细胞中vWF的免疫荧光染色。肌动蛋白用phalloidin染色(绿色)，细胞核用DAPI染色(蓝色)。

　　区分直接和间接免疫荧光。在直接免疫荧光中，一抗直接偶联到荧光团（也称为荧光色素），便于处理和快速可视化。在间接免疫荧光中，使用特异性结合一抗的二级荧光团偶联抗体来可视化感兴趣的结。

　　尽管di二种方法比直接免疫荧光更耗时，但它有几个显著的优势，比如它通常更便宜，因为二抗可以用于不同的一抗。此外，通过结合多个一抗和特定的二抗(每个抗体都用不同的荧光团标记)，可以在单个样品中平行特异地显示多个蛋白质(多色免疫荧光)。

　　免疫荧光染色:典型的工作流程

　　每个免疫荧光染色方案由培养、固定、染色、成像四个主要步骤组成，可细分如下:

　　免疫荧光染色是一种非常敏感的方法，可能需要排除故障《免疫英冠染色故障排除指南》。方案中的微小变化可能会导致不同的结果，而这些结果不再具有可比性。因此，在您的特定方案中精确地保持完全相同的条件是非常重要的(例如，细胞密度、抗体稀释度、培养温度和培养时间)。

　　免疫荧光实验方案对比

　　传统染色与ibidi方案染色

　　当使用任何ibidi解决方案时，ibidi的免疫荧光染色方案比传统方案要简便快速的多。无需在松散的盖玻片上生长细胞，细胞可直接在ibidi玻片上生长和染色。

　　用于免疫荧光应用的各种ibidi产品

　　更多ibidi相关产品的免疫荧光实验应用可查阅我们雷萌公众号相关文章！

　　参考文献

　　K.G. Zyner, A. Simeone, S.M. Flynn, et al. G-quadruplex DNA structures in human stem cells and differentiation. Nat Commun, 2022, 10.1038/s41467-021-27719-1

　　C. Xu, et al. NPTX2 promotes colorectal cancer growth and liver metastasis by the activation of the canonical Wnt/beta-catenin pathway via FZD6. Cell Death & Disease, 2019, 10.1038/s41419-019-1467-7

　　Kobayashi, T., et al. Principles of early human development and germ cell program from conserved model systems. Nature, 2017, 10.1038/nature22812

　　H. Tada et al. Porphyromonas gingivalis Gingipain-Dependently Enhances IL-33 Production in Human Gingival Epithelial Cells. PloS one, 2016, 10.1371/journal.pone.0152794

　　Read article

利用微流控技术在微流控芯片通道内进行实时的细胞培养对很多生物学、医学等领域的工作人员来讲是一个重大的挑战和机会，通过该技术可以大规模的降低实验耗材消耗，提高实验转化效率，模拟实际生物环境下的细胞生长行为等。在科学研究和工业应用中，活细胞成像的细胞培养都具有较大的应用前途，那么现在有没有一款或一套合适的仪器来做细胞培养实验呢？答案是有的，Elveflow微流控灌注套装（Perfusion Pack）结合ALine公司的Microslides便可以完成细胞培养实验。

Elveflow微流控OB1压力控制器的详细介绍：Elveflow微流控压力泵/压力控制器OB1（四通道）简要介绍

更加详细的内容介绍，请查看如下链接：http://blog.sina.com.cn/fangdzxx

也可以随时关注我们的微信公众号：信号测量与微流控系统