【免费直播】流式细胞术1小时带你弄懂，助你攻克实验难题！

单细胞样本制备老失败？

流式实验得到数据不可靠？

流式图不知道怎么分析？

「全线赋能“沃”的实验」之实验方法实战教程

直播第四期将带来

《流式细胞术》

从单细胞制备到流式细胞术，理论+实例

带你快速get到其中的难点要点

直播时间

5月31日（周二）19：00

报名方式

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主题：单细胞悬液样本的分类及制备

• 单细胞悬液样本类型

• 制备注意事项

• 制备方法实例

讲师：冯启峥

瑞沃德高级产品方案经理，专注动物传染病学和细胞与分子免疫学研究多年，在动物疫苗研发、CRISPR的原核细胞应用方面有着较为丰富的经验，致力于为客户提供专业的细胞与分子生物研究方案。

主题：流式细胞术的原理及应用

• 仪器基本结构解析

• 实验方法实操讲解

• 技术应用介绍

讲师：方晟

昆明理工大学硕士研究生，已发表SCI论文4篇，在载体构建、药物活性筛选、肿瘤模型构建、单细胞数据分析等方面有着丰富的经验，研究方向主要是抗肿瘤药物的抗 癌机理和单细胞测序分析。

上期直播间互动问题

这次我们全部为小伙伴解答

1、做外周神经损伤的小鼠能活多久？如何饲养？

外周神经损伤一般不会造成动物的死亡，但一些特殊情况会影响动物的存活率，比如为了避免在手术部位引起不良组织炎症，我们应该尽量缩短手术时间，如果手术部位意外出血，要用棉签适当按压。如果出血没有停止，就不要对这只动物进行进一步的实验。术后动物应该放进干净的鼠笼并分笼饲养，注意保温。

2、脊髓损伤造模后，动物出现功能障碍不能自主排尿该如何护理？

每日按压排尿3次，以防泌尿系统感染；连续3天，每天两次向腹腔注射相同剂量青霉素预防感染。

3、使用纤维蛋白胶修复的是外周神经损伤的哪个类型或者说等级呢?

纤维蛋白胶可以应用于横断的神经，帮助受伤神经的近端和远端残端紧密对齐，是神经缝合技术的一种替代方式。

4、坐骨神经挤压的结扎力度如何把控？

有一些文献上会使用带有力值的工具进行挤压神经，如果我们没有这类的工具，可以使用血管夹对神经进行夹持，保证力度的一致性。

5、有专门评估大小鼠前肢抓取能力的行为学实验吗?

针对于前肢的抓取能力，爪抓力测试仪可以测动物前肢，后肢的抓力，另外如果是判断动物前肢抓取食物的精细运动，可以用楼梯式抓取测试仪来进行。

6、目前好像2D步态分析居多，慢慢也看到了3D步态分析，两者相比各自有什么优缺点呢?

步态没有2D、3D的区别，国内使用较多的步态有2种：第一种是依靠压力感应可以生成动物脚掌受力的情况，判断动物的损伤情况；第二种是通过视频记录动物足部在运动时的轨迹，通过足部的运动过程计算生成动物活动过程中四肢运动的各项指标来判断动物的损伤情况。这两种方法从2个不同的方面完善了步态的分析数据，但实际上无法互相替代。一般来说大鼠步态用第一种压力感应测试的会多一些，小鼠步态则用视频记录的多一些。所谓的3D步态是通过从侧面拍摄动物运动时的腿部活动，对动物的步态运动进行更为细致的评估，与传统步态记录的是2个维度的信息，无法进行替代。由于需要识别动物腿部的关节，目前无法与足底步态很好的融合结果。

7、这种转棒实验是可以大小鼠通用的吗？如何检测到掉落？

转棒大小鼠主机通用，但是跑道是需要替换的。设备通过红外感应，电子感应等自动检测动物掉落情况，停止计时。

8、外周神经损伤会导致疼痛致敏，在模型检测中可以用什么疼痛检测方法呢？

主要看测痛的部位，机械痛一般可以用vonfery针或电子测痛仪来进行测试，针对不同部位也有面部疼痛测试仪（三叉神经），压感测痛仪（背部，较大的关节），钳式测痛仪（整个脚，细小的关节），热痛一般测试动物足底或尾部，使用红外测痛仪或者甩尾测痛仪。

9、怎么手动排尿？

按摩膀胱。

10、每天需要按摩多久？

术后需轻轻按摩挤压膀胱进行排尿，每次按摩到排空，每天至少三次。

11、不规则梯和错步分析仪是不是指一个东西啊？

是一种类型的仪器，不同厂家的名称，测试方法，输出的指标会略有不同。

12、转棒实验一直做不出差异怎么办？

可能有2种原因：

①测试时动物已经恢复到与正常鼠一致的水平，所以做不出差异。

解决方法：将转棒测试时间提前。

②测试难度过于简单或者过于困难，导致差异很小，从而统计分析结果无差异。

解决方法：调整实验难度，直到可以做出差异的结果。新型转棒仪除了原先的匀速和匀加速以外还增加了阶段加速等测试方法，实验难度有了更大的调整空间。

13、两爪及四爪攀爬实验有合适的实验设备吗？

不规则梯结合自制实验设备。

14、脊髓损伤后有哪些评估手段？

脊髓损伤后可通过行为学对运动及感觉进行评估。BBB法：一般用于观察大鼠后肢行走及肢体活动，评分分为三个部分，0-7分评判动物后肢关节活动情况，8-13分评判后肢步态及协调功能，14-21分评判运动中爪的精细活动；BMS评分是在BBB评分基础上针对小鼠的运动特点做出了完善和修改，是专门用于小鼠后肢功能的评分方法。其他运动相关行为学：步态分析系统用于评估步态动力学、协调性分析、平衡性分析等；转棒仪可评估动物的运动协调性；行走障碍分析仪可分析简单步态及运动协调性等。感觉功能相关行为学：Vonfrey测痛针用于评估对触碰的敏感性；冷热盘用来测试动物对冷热刺激的敏感度。

15、平衡木也可以做小鼠吗 ？

有小鼠平衡木可以进行小鼠实验。

16、请问外周神经损伤后有哪些手段可以评价感觉功能的损失？

感觉功能相关行为学：机械痛一般可以用vonfery针或电子测痛仪来进行测试，评估对触碰的敏感性，针对不同部位也有面部疼痛测试仪（三叉神经），压感测痛仪（背部，较大的关节），钳式测痛仪（整个脚，细小的关节），热痛一般测试动物足底或尾部，使用红外测痛仪（用于量化对小鼠和大鼠后爪辐射或红外热刺激的热阈值的方法）或者甩尾测痛仪（一种基于对啮齿动物中热刺激回避反应的潜伏期测量的疼痛实验）。

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在日常膜片钳实验时，你是否也被这些问题困扰？

操作十分复杂，一不小心就出错

注意事项多，包括如何排除噪音、提高封接成功率等等

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8月23日（周二）19：00，「大成学堂」特邀南京大学张洋浔博士做客直播间，为大家带来“膜片钳技术解析与经验分享”。通过本次直播课程，你可以收获膜片钳技术的详细解析、多年实验操作经验、日常操作注意事项等方面的专业知识，还可在线提问获得详细解答。 

张洋浔 博士

南京大学博士，致力于研究内源性神经递质/调质系统及外源性药物对前庭代偿的影响及神经机制，擅长应用全细胞膜片钳记录、环路示踪、光/化学遗传学操控方法、光纤记录等实验技术。相关研究成果发表在Journal of Neuroscience, Biomedicine & Pharmacotherapy, Neuroscience Bulletin等学术期刊。

8月23日（周二）19：00

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实验动物该怎么选择？

不同脑缺血模型，弄不清对应构建方法？

常用的血流监测技术，你都掌握了吗？

「全线赋能·“沃”的实验」之实验方法实战教程

直播第五期为大家聚焦

《脑缺血模型构建及检测》

从实验动物的选择、不同模型的分类

各个模型的构建方法到血流监测技术

两位老师将进行综合详细的讲解

全面助力你的科研实验研究

直播时间

6月21日（周二）19：00

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主题：脑缺血模型构建

• 脑缺血研究背景

• 脑缺血动物模型构建

• 脑缺血模型构建实验仪器

讲师：孙绍强

瑞沃德行业解决方案专家，在膜片钳/钙成像/干细胞诱导方面有着丰富的实验经验，曾参与多项重大研发及自然科学基金项目，曾在Cell Stem Cell 上发表论文，专注于神经疾病，脑缺血及神经退行性疾病模型制备和机制研究，已为上百家客户提供专业的神经疾病整体解决方案。

主题：脑卒中研究中的血流监测技术

• 激光多普勒

• 激光散斑

• 超声多普勒

• 核磁共振成像

• 双光子显微镜

讲师：殷维君

瑞沃德微循环监测解决方案专家，在生理信号监测和血流血氧成像领域拥有丰富的经验，主导动物活体成像解决方案的设计及优化，专注于临床及临床前微循环监测解决方案的构建。

上期直播间互动问题

这次我们全部为小伙伴解答

Q1：组织剪切的大小有没有具体要求，肿瘤组织一般2-4mm可以吗？

A1：这要根据组织类型去判断，一般会预处理成10mm左右的组织块，太大可能会导致处理不完全，太小可能导致细胞死亡增加，甚至导致样本变稠等。

Q2：细胞活率80%就可以了吗，看到一些资料写的都要90%以上。

A2：这个需要根据下游实验的需求灵活调整，如果样本存活率不能达到要求的话，除了优化实验条件以外，还可以通过一些死细胞去除的试剂来优化已获得的样本。

Q3：低温解离细胞与常规的37度制备单细胞优势分别是什么？区别是什么？

A3：37℃条件下进行组织解离，由于细胞转录活跃，因此解离过程中基因表达可能会发生改变，可能会干扰应激反应相关基因表达，所以在进行snRNA-seq时可以通过使用冷活性酶释放细胞核，同时一些热敏感或者脆弱的细胞更适合采用低温解离的分离方式，但是低温条件对一些质密难解离的组织的处理效率可能会降低。

另外，温度对不同细胞种类也有一定影响，比如在进行脑组织解离时，热解离可能会影响神经元和星形胶质细胞的获取，但是会大量富集小胶质细胞，所以在进行组织解离时，根据获得目的细胞的需求要灵活调整解离方案。

Q4：裂红处理有什么注意事项吗？

A4：如果直径6-8μm的细胞占比较高，且有核率偏低，这表明红细胞含量可能较多，需要进行红细胞裂解，如果红细胞裂解依然不干净，不建议增大裂解体系，建议适当延长裂红时间，或适当增加裂红次数。

Q5：流式染色时间及温度如何选择？

A5：染色本身取决于抗体抗原之间的结合能力，染色时间和温度，受限于抗体浓度，一般根据选择抗体的说明书推荐的浓度和孵育时间、温度选择。我的实践经验：当不清楚说明书的情况，我会选择室温染色12-15min（取决于抗体浓度微调），或4度冰上30min。注意染色时间尽量不要让细胞破损，否则死细胞碎片会影响流式结果。此外细胞消化完毕后应该尽快染色处理，特别是一些凋亡染色、胞内酶染色为保持细胞物质活性，应尽快染色。

Q6：请问流式细胞实验中单抗进行荧光需要什么样的对照？

A6：关于对照设置，这个比较复杂，一般我们是选择同型对照作为阴性对照组，得到的结果往往是比较好的。所谓的同型对照就是同种属同亚型、相同荧光标记物、使用剂量和浓度相同，且属于非特异性结合的抗体为同型对照组。通常用来消除抗体与抗原的非特异性结合造成的背景染色。 

还有一类就是最常见的纯阴性对照，检测细胞群不进行任何抗体处理，直接进行流式检测，这就是简单消除细胞和溶剂本身的影响，这种方法的好处是节约抗体，毕竟抗体很贵。

Q7：如何减少补偿的干扰？

A7：补偿干扰往往是多激光的流式仪器才会发生一定干扰情况，此时，可以根据抗体公司提供的染料搭配方案选择比较好，也就是发射光谱的波长峰尽量不重叠的染料，这样补偿干扰会尽量消除。因此，往往需要查看染料的波长范围，此外，对于4色以上的多色标记情况，一般不常见，此时往往染料的波长范围难以避免的重叠，这时候，推荐使用抗体公司推荐的配色方案，尽量避免发射光谱的重叠。此外很多流式仪器配套软件都带一定算法对补偿进行修正，可以适当修正这个影响。

Q8：细胞自发荧光如何解决？

A8：细胞自发荧光往往是细胞内物质带有荧光，植物细胞因为叶绿素原因会自带一定荧光，然后一些药物处理下，药物本身带有发色基团，也可能自荧光，此时，纯阴性对照的设置可以补偿一定的情况。然后就是染料的选择情况，染料荧光波长范围避免与细胞自发荧光的波长的重叠，这样会比较好一些。我之前做药物的细胞凋亡实验时候，考虑到药物的情况，就没有使用常见的凋亡检测的Annexin V染料，而改用Annexin V-APC 。尽量设置纯阴性对照、有条件做下同型对照，往往可以在数据处理时候适当减少部分因素的影响。这样流式的结果会更好。

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