一文掌握MIQE指南的RT-qPCR发表数据的实用方法

考虑到mRNA转录的高度动态特性以及样品处理和下游处理步骤中引入的潜在变量，RT-qPCR工作流程的每个步骤的标准化方法对于可靠和可重现的结果至关重要。MIQE为这种方法提供了一份包含85个参数的清单，以确保质量结果符合任何期刊的接受标准。接下来，小编将为大家详细介绍如何应用MIQE指南来建立一个可靠的RT-qPCR实验流程。

1、实验设计

正确的实验设计是任何基因表达研究的关键。由于mRNA转录对与研究过程无关的外部刺激敏感，因此严格控制和设计实验条件的工作是十分重要的。其中包括了确定实验程序、对照组、重复组的类型和数量、实验条件以及各组内的样品处理方法等，这些对于最小化变异性至关重要（表1）。

2、RNA提取及质控

样品需-80℃冷冻或使用RNA储存溶液进行储存。RNA提取程序应包括DNA酶处理步骤，以去除任何的基因组DNA污染。

确保仅使用高纯度（无污染物）和高完整性（未降解）的RNA是RT-qPCR实验工作流程中最关键的一点。RNA样本中的杂质可能导致RT和PCR的YZ，从而导致不同和不正确的定量结果。由于样品纯度和完整性不相关，因此应评估两者确定RNA样本符合下游工作流程的ZD验收标准。

3、逆转录

考虑到RNA酶在环境中的普遍存在，建议在质量控制评估后立即将总RNA样本反转录成cDNA。这将避免RNA样品在转化为cDNA之前多次冷冻/解冻而降解的风险。对于RT步骤，关键是确保提取的RNA样本中转录基因组的一致性和完整性。建议使用相同数量的总RNA，并保持所有实验样本的反转录反应时间，以最小化生物复制之间的变异性。

4、引物和扩增子设计

引物设计和靶序列的选择是保证扩增产物特异性和GX性的关键。目前有许多软件或在线网站可设计引物对和确定扩增子，比如DNAMAN、Primer Premier、Oligo、Beacon Designer、Primer-Blast、BathPrimer、Primer3 Plus等等。

5、qPCR验证

qPCR验证是使用一组标准样品对引物退火温度、反应效率和特异性的适度范围进行评估的方法。具体步骤如下：

1)根据仪器类型，选择合适的耗材和qPCR试剂；

2)配置不同的PCR反应体系，凝胶电泳检测引物适宜浓度以及特异性；

3)设置温度梯度测试引物适宜退火温度；

4)实验设置NTC、NRC、POS和NEG等对照组，来监控实验体系或污染；

5)标准曲线的建立(评价PCR效率)。

6、内参基因的选择

在RT-qPCR实验中，内参基因可以用于校正上样量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。一个好的内参基因应在不同时空样本或不同处理样本中具有相对稳定的表达水平，常见的有ATCB、GAPDH、β-actin、18S rRNA等。

7、实验重复性

基因表达实验中有两种可能影响结果的变异来源：

1)由于个体有机体、组织或细胞样品之间基因表达水平的固有差异引起的生物变异性；

2)实验过程本身的技术变异性，通常与移液器误差、操作误差或样品质量和数量有关。为了减轻生物和技术变异性的影响，一般认为至少三次生物学重复和技术重复。

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//什么是气管插管？为什么要进行气管插管？

气管插管（以下简称插管）是指将一特制的气管内导管经声门置入气管，进而打开病患呼吸道，为气道通畅、通气供氧、呼吸道吸引和防止误吸等提供ZJ条件。插管是实施危重病患抢救过程中的一项重要技术，也是实施吸入麻醉的基础操作。

气管插管的主要作用：

◆ 保持气道通畅：防止口腔分泌物和胃内容物被误吸。

◆ 通气供氧：良好的氧气供应和辅助通气有助于机体的组织氧供，可以有效预防并发症出现，并在术中出现紧急情况时及时进行急救。

◆ 控制麻醉深度：相比于注射麻醉和面罩吸入麻醉，经气管插管可以有效地控制通气从而控制麻醉深度；同时插管可以防止麻醉气体向周围环境的逸散，保护手术人员不会较多地吸入麻醉药。减少麻醉气体的浪费，更经济。

//最常用的犬猫气管导管-Murphy型

①接头-连接麻醉机供气系统；②导管；③套囊-密闭气道、避免误吸、固定导管、保护气管（保持导管位于气道ZY，避免JD损伤气道）；④测试球囊-给套囊充气，可判断充气是否合适；⑤充气连接管；⑥Murphy孔-可以防止导管JD意外贴于气管壁时发生通气堵塞；⑦JD。导管外壁标识，ID为导管内径（mm）；OD示值为导管外径（mm）；刻度（cm）10、12、14、16、18…表示导管JD到刻度的距离，提示导管插入深度。

//如何选择合适的气管插管？

◆ 根据动物的体重选择对应规格的气管导管：

▲Tip：体重非常小的动物，管径选择1.5, 2.0, 2.5mmID；特定品种不适用，短头品种一般气管较细，需要的型号较小；长吻犬的气管较粗，需要的型号大。所以临床应用还要结合体型、品种等因素综合评估。

◆ 对比动物的鼻中隔：将气管导管JD抵于动物鼻中隔处，选择外径和鼻中隔宽度相当气管导管，同时另取前后两个ID（一大一小）的气管导管备用。

▲Tip：兽医还是要在具体操作的过程中根据实际情况做调整。

//气管插管前需要做哪些准备？

◆ 润滑剂或局麻剂：利多卡因凝胶

◆ 3种型号的气管插管

◆ 纱布若干

◆ 无针头注射器&套囊压力计

◆ 喉镜，确认光源没问题

//如何进行气管插管？

划ZD：气管插管操作

◆ 选择合适的气管导管（见前文）

◆ 检查气管插管套囊有无漏气：用注射器针管通过测试球囊向套囊注射空气使套囊充盈，按压套囊，套囊漏气则废弃，不漏气的可准备实施气管插管。

◆ 修剪插管为合适长度：比对犬齿到肩胛骨中前缘（第2-3肋骨处）的距离，拔掉接口，修剪插管为合适长度，重新连接接口即可。

◆ 导管壁涂利多卡因凝胶(必要时可将利多卡因气雾剂喷于喉头)，以减少喉痉挛

◆ 保持下颌与颈成一条直线，开口，拽出舌头

◆ 配合喉镜，将插管经声门裂插入气管

◆ 套囊适度充气，用套囊压力计量取压力在20 cmH2O；如无套囊压力计，则使用注射器充盈到合适压力，如下图：

◆ 确认插管正确插入：①导管插入气管内 ②导管插入深度合适 ③气道密闭

1. 直视法：看到插管位于气管内；

2. 呼吸袋、气道压力表、呼吸活瓣伴随动物呼吸或人为按压胸廓有同步变化

3. 透明管上可以看到呼出的雾气；

4. 触诊颈部只能摸到一个刚性管状结构；

5. 正压通气时可听诊肺音，可看到胸壁膨胀；

6. 通过呼气末CO2数值及波形图进行判断

◆ 固定插管，连接麻醉机

//拔气管插管的时机

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目前，越来越多的领域都会用到数字PCR（dPCR）技术，但关于实验细节和结果评估缺少一个共识。在很多发表的文章中都缺乏足够的dPCR实验细节，这样不利于评审文章，甚至难以根据文章重复实验。

为了让大家更好地遵循MIQE进行实验，科学家依托于法国Stilla Technologies的Naica数字PCR平台发布了一篇文章Reproducible and Sensitive Assays using 3-and 6-colour Crystal Digital PCR™ for Detecting Point Mutations in Human Breast Cancer，通过6色荧光数字PCR技术检测了乳腺癌相关靶点，并借此阐述了整个数字PCR操作流程以及如何运用MIQE。

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