【Application Note】加工肉类的水分、脂肪和蛋白质分析

摘要

40多年来，CEM一直是食品分析的先驱，与大大小小的公司合作，开发更好的工艺以提高产品质量。在这个应用说明中，我们展示了直接分析加工肉类产品的好处，这些产品通常含有混合成分，并不总是符合传统测试方法。拥有正确的水分、脂肪和蛋白质分析水平可以转化为安全、有利和持久的高质量产品。

简介

加工肉制品，如香肠、腊肠和肉干，由于产品的非均质性，通常含有草药、香料、防腐剂和其他非肉类成分，导致难以分析。传统的湿化学分析，如化学脂肪提取或凯氏消解法分析蛋白质，都很昂贵。消解法进行蛋白质分析，既昂贵又耗时，而且需要使用危险化学品。湿化学方法经常被非肉类添加剂所影响，导致不准确的结果和随后的配方错误。近红外光谱法（NIR）是一种快速替代湿化学方法的检测方法。近红外光谱法是湿化学方法的快速替代方法，在不到一分钟的时间内提供结果，而且不会使用危险化学品。然而，近红外和傅立叶红外等光学方法需要非常高的样品均匀度，并且必须根据配方中使用的添加剂的数量进行校准。颜色、浓度或配方的变化会对结果产生负面影响，从而使获得准确的结果变得很困难。

SMART 6™和ORACLE™系统的结合提供了快速的水分和脂肪测定，其结果在5分钟内完成。SMART 6水分和固体分析仪利用双频能量，在3分钟或更短时间内快速分析任何产品，无论是湿的还是干的，都能在3分钟或更短时间内完成。ORACLE通过完全隔离脂肪分子的信号，消除了对方法开发的需要。即使在复杂的样品基质中，也能完全隔离脂肪分子的信号。

Sprint®是一个直接的蛋白质测量系统，它利用染料结合技术确保只检测真正的蛋白质。而不是总氮，因为总氮在非蛋白氮存在的情况下会导致错误的测量。Sprint不需要定期校准，而且任何实验室用户都可以很容易的创建方法。与之相竞争的快速技术（近红外、FT-IR、TDNMR）由于颜色、质地和浓度的变化，每个独特的样品都需要持续的、昂贵的校准和方法开发。这项研究表明，CEM的创新技术可以快速分析各种加工肉类的水分、脂肪和蛋白质，其准确性和精确度与参考方法相当。

实验

为了评估SMART 6、ORACLE和Sprint的性能，我们获得了五种加工肉类产品：热狗、奶酪香肠、香肠、半干香肠、牛肉棒和火鸡棒。为了测定水分，每个产品中取2克在SMART 6中进行了分析。参考测试在烘箱中进行，一式三份，以建立一个比较的基础。烘箱法被设定为在100°C下8小时，然后在干燥状态下冷却一段时间，以确保完全干燥。为了进行脂肪分析，将干燥后的样品从SMART 6中取出，放在ORACLE中，扫描30秒。测试前无需校准或方法开发。脂肪参考测试是使用索氏提取法进行的。对于蛋白质分析，将1克样品称量到Sprint样品杯中，然后放入Sprint装置中。染料结合反应是完全自动化的，大约需要4分钟完成。蛋白质的结果与凯氏消解法进行了比较。

结果

使用CEM的快速技术，水分、脂肪和蛋白质的平均结果与参考结果相比非常接近，如表1、2和3所示。

表1.SMART 6和烘箱之间的水分含量比较

表2.ORACLE和参考化学之间的脂肪含量比较

表3.Sprint和凯氏消解法之间的蛋白质含量比较

结论

对于加工肉类产品，正确的水分、脂肪和蛋白质水平对产品质量和生产可行性至关重要。对于那些要求高质量和高性能的加工肉制品，CEM提供了快速的测试方案，其结果与参考方法一致。与CEM的专 利技术相结合，转化为市场上最快、最准确的食品成分测试。SMART 6、ORACLE和Sprint分析仪节省了时间，结果准确，以最 低成本的方案帮助您节省资金。

摘要

•微波增强的多肽固相合成（SPPS）能够快速有效地进行大体积氨基酸（如Aib和N-Me-A）的常规困难偶联

• 酰基载体蛋白衍生物VQAibAibIDYINGOH和VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的合成在2小时内完成，纯度分别为95%和86%

• GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2的合成在3小时内完成，纯度为 89%

介绍

在许多生物学相关的化合物中都可以找到受阻的非标准氨基酸，例如α-氨基异丁酸(Aib)和N-甲基丙氨酸((N-Me)-A)（图1）1-3。然而，包括Aib或N-甲基化氨基酸的肽合成已被证明具有挑战性；第二个甲基引入的空间位阻，无论是在α-碳还是酰胺氮上，都使这些氨基酸衍生物在传统SPPS中难以偶联。

图1 位阻、非标准氨基酸

然而，通过使用微波增强的SPPS，与受阻非标准氨基酸相关的困难已被最小化。在SPPS中使用微波能量可以快速有效地完成大体积氨基酸（如Aib和N-甲基丙氨酸）的常规困难偶联4,5。

材料和方法

试剂

N-α-Fmoc-α-氨基异丁酸获自AnaSpec(Freemont,CA)。Fmoc-N-Me-Ala-OH获自Peptides International(Louisville,KY)。所有其他氨基酸均获自CEM Corporation(Matthews,NC)，并含有以下侧链保护基团：Asn(Trt)、Asp(OMpe)、Gln(Trt)、Glu(OtBu)、Lys(Boc)、Ser(OtBu) 和Tyr(tBu) 。Oxyma Pure和Rink Amide ProTideTM LL树脂购自CEM Corporation(Matthews,NC)。N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)获自CreoSalus(Louisville,KY)。Fmoc-Gly-Wang Resin LL购自NovaBiochem(St.Louis,MO)。哌啶获自Alfa Aesar(Ward Hill,MA)。三氟乙酸(TFA)、3,6-dioxa-1,8-octanedithiol(DODT)、三异丙基硅烷(TIS)和乙酸购自Sigma-Aldrich(St.Louis,MO)。二氯甲烷(DCM)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙 醚(Et2O)购自VWR (West Chester,PA)。HPLC级水(H2O)和HPLC级 乙 腈(MeCN) 购 自 Fisher Scientific (Waltham, MA) 。

多肽合成：GEQKLGAibAibAibASEESLG-NH2

使用CEM Liberty Blue™自动微波肽合成仪在Rink Amide ProTide LL树脂（离子交换容量：0.18meq/g）上以0.1mmol规模制备多肽。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系统进行切割。裂解后，肽在无水乙 醚中沉淀并冻干过夜。

多肽合成：VQAibAibIDYING-OH

使用CEM Liberty Blue自动微波肽合成仪在FmocGly-Wang LL 树脂（离子交换容量：0.33meq/g）上以0.1mmol规模制备。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系统进行切割。裂解后，肽在无水乙 醚中沉淀并冻干过夜。

多肽合成：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH

使用CEM Liberty Blue自动微波肽合成仪在FmocGly-Wang LL 树脂（离子交换容量：0.19meq/g）上以0.1mmol规模制备肽。用哌啶和Oxyma Pure在DMF中进行脱保护。使用DMF中的DIC、DMF中的Oxyma Pure和5倍过量的Fmoc-AA-OH进行偶联反应。使用具有 TFA/H2O/TIS/DODT的CEM Razor高通量肽切割系统进行切割。裂解后，肽在无水乙 醚中沉淀并冻干过夜。

多肽分析

在配备有PDA检测器的Waters Acquity UPLC系统上分析肽，该检测器配备Acquity UPLC BEH C8柱（1.7mm和2.1x100mm）。UPLC系统连接到Waters 3100 Single Quad MS用于结构测定。在Waters MassLynx软件上进行峰分析。使用(i)H2O和(ii)MeCN中的0.1%TFA梯度洗脱进行分离。

结果

在Liberty Blue自动微波肽合成仪上GEQKLGAibAibAibAibASEEDLG-NH2的微波增强SPPS产生了89%纯度的目标肽（图2）。

图2.GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2的HPLC色谱图

在Liberty Blue自动微波肽合成仪上的VQAibAibIDYING-OH的微波增强SPPS产生了纯度为95% 的目标肽（图3）。

图 3：VQAibAibIDYING-OH的HPLC色谱图

在Liberty Blue自动微波肽合成仪上的VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的微波增强SPPS产生了纯度为86%的目标肽（图4）。

图 4：VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的HPLC色谱图

结论

微波增强的SPPS能够快速有效的进行大体积氨基酸（如Aib和N-Me-A）的常规困难偶联。常规合成GEQKLGAibAibAibASEEDLG-NH2需要40小时且纯度< 10%，但微波增强SPPS在3小时内产生目标肽且纯度为89%。此外，酰基载体蛋白衍生物VQAibAibIDYING-OH和VQ(N-Me-A)(N-Me-A)IDYING-OH的合成在2小时内完成，纯度分别为95% 和86%。微波增强的SPPS已被证明是一种有效的工具，可以最 大限度地减少SPPS中受阻的非标准氨基酸相关的困难。

参考文献

1. Mueller, P.; Rudin, D. O. Nature. 1968, 217, 713–719.

2. Rebuffat, S.; Goulard, C.; Hlimi, S.; Bodo, B. J. Pept. Sci. 2000, 6, 519–533.

3. Ahmed, G.; Elger, W.; Meece, F.; Nair, H. B.; Schneider, B.; Wyrwa, R.; Nickisch, K. Bioorg. Med. Chem. 2017, 25, 5569–5575. 

4. Collins, J. M. Microwave-Enhanced Synthesis of Peptides, Proteins, and Peptidomimetics. In Microwaves in Organic Synthesis, Third Edition; de la Hoz, A.; Loupy, A.; Wiley-VCH: Weinheim, 2012; 897–959.

5. Ben Haj Salah, K.; Inguimbert, N. Org. Lett. 2014, 16 (6), 1783–1785.