免疫荧光抗体经尾静脉注入小鼠体内可以存活多久

　　小鼠狂犬病毒抗体(RVAb)酶联免疫分析试剂盒使用说明书

　　本试剂盒仅供研究使用。

　　检测范围：96T5IU/L-150IU/L使用

　　目的：本试剂盒用于测定小鼠血清、血浆及相关液体样本中狂犬病毒抗体(RVAb)含量。实验原理本试剂盒应用双抗原夹心法测定标本中小鼠狂犬病毒抗体(RVAb)水平。用纯化的抗原包被微孔板，制成固相抗原，往包被的微孔中依次加入狂犬病毒抗体(RVAb)，再与HRP标记的抗原结合，形成抗原-抗体-酶标抗原复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的狂犬病毒抗体(RVAb)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线计算样品中小鼠狂犬病毒抗体(RVAb)浓度。

　　试剂盒组成

　　130倍浓缩洗涤液20ml×1瓶7终止液6ml×1瓶2酶标试剂6ml×1瓶8标准品(240IU/L)0.5ml×1瓶3酶标包被板12孔×8条9标准品稀释液1.5ml×1瓶4样品稀释液6ml×1瓶10说明书1份5显色剂A液6ml×1瓶11封板膜2张6显色剂B液6ml×1/瓶12密封袋1个标本要求1.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融2.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步骤

　　1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。120IU/L5号标准品150μl的原倍标准品加入150μl标准品稀释液60IU/L4号标准品150μl的5号标准品加入150μl标准品稀释液30IU/L3号标准品150μl的4号标准品加入150μl标准品稀释液15IU/L2号标准品150μl的3号标准品加入150μl标准品稀释液7.5IU/L1号标准品150μl的2号标准品加入150μl标准品稀释液2.加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。7.温育：操作同3。8.洗涤：操作同5。9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色10分钟.10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。11.测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

　　操作程序总结：

　　计算：

　　以标准物的浓度为横坐标，OD值为纵坐标，在坐标纸上绘出标准曲线，根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;再乘以稀释倍数;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式，将样品的OD值代入方程式，计算出样品浓度，再乘以稀释倍数，即为样品的实际浓度。

　　注意事项

　　1.试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

　　2.浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。3.各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

　　4.请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高(样本OD值大于标准品孔第一孔的OD值)，请先用样品稀释液稀释一定倍数(n倍)后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数(×n×5)。

　　5.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　6.底物请避光保存。

　　7.严格按照说明书的操作进行，试验结果判定必须以酶标仪读数为准.8.所有样品，洗涤液和各种废弃物都应按传染物处理。

　　9.本试剂不同批号组分不得混用。

　　保存条件及有效期

　　1.试剂盒保存：;2-8℃。

　　2.有效期：6个月

前言

免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，它是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。

直接法

将标记的特异性荧光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。

间接法

如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗体—抗原—抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。

标记的抗抗体是抗球蛋白抗体，同于血清球蛋白有种的特异性，如免疫抗鸡血清球蛋白只对鸡的球蛋白发生反应，因此，制备标记抗体适用于任何抗原的诊断。

一、实验步骤

免疫荧光实验的主要步骤包括 样片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育、封片及荧光检测等。

1、 样品准备

对于单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过（70%乙醇中浸泡）的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片即可，操作过程要小心，防止细胞脱片。

对于悬浮生长细胞，有两种方式，一种是取对数生长细胞，制备细胞片或直接制备细胞涂片，把细胞片浸入封闭液中固定，封闭后滴加一抗和二抗孵育；另一种是先在悬浮液中进行固定和染色，离心洗脱后，用移液管移至盒式玻片进行后续抗体孵育。

对于冰冻切片制备，建议用新鲜组织，否则组织细胞内部结构破坏，易使抗原弥散。组织一定要冷冻适度，切片时选用干净锋利的刀片，防止裂片和脱片。

对于石蜡切片的制备，要先进行脱蜡和抗原修复的处理。

2、固定

做好切片并风干后立即用合适的固定液（固定液包括有机溶剂和交联剂，其选择取决于抗原的性质及所用抗体的特性）进行固定，尤其要较长时间保存的白片，一定要及时固定和适当保存。

固定时间则取决于固定组织切片的大小和类型，对大多数组织，18-24h即可，而细胞的固定时间较短。

3、通透

针对胞内抗原，使用0.5% Triton X-100或丙酮等通透剂进行通透，这一步的目的是使抗体进入胞内。

4、封闭

为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用封闭液（一般包括与二抗同一来源的血清、BSA或者羊血清）封闭，减弱背景着色。封闭开始后，要注意样品的保湿，避免样品干燥，否则极易产生较高的背景。

5、一抗孵育

一抗孵育温度一般分为：4℃、室温、37℃，其中4℃效果更佳；孵育时间与温度、抗体浓度有关，一般37℃孵育1-2h，4℃过夜（从冰箱拿出后37℃复温45min）。具体条件还要根据样品、稀释液等条件进行摸索尝试。

6、荧光二抗孵育

荧光二抗孵育一般在室温或37℃孵育30min-1h，该过程必须在避光环境下进行，防止荧光淬灭。荧光素标记的二抗随着保存时间的延长，可能会有大量的游离荧光素残留，需要注意配制时采用小包装并进行适当的离心。

7、复染

一般采用DAPI进行复染，目的是形成细胞轮廓，从而对目标蛋白进行定位。

8、封片

为了长期保存，我们需要对样本进行封片，用吸水纸吸干爬片上的液体，一般用缓冲甘油等或专门的抗荧光淬灭的封片液。

9、 荧光观察

有条件的话立即用荧光显微镜观察拍照，若不能及时拍照，也要做好封片和封固，保持避光和湿度。荧光显微镜的成像能力对最终的结果也会造成很大的影响，好的荧光显微镜能够最大限度地收集荧光信号，并呈现高分辨率的图片，使细节更清楚，更易得到一张效果极佳的结果图。

注意：

切片清洗：为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要，一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次，而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。

(1)单独冲洗，防止交叉反应造成污染；

(2)温柔冲洗，防止切片的脱落。可使用浸洗方式；

(3)冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质；

(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求（建议PH在7.4-7.6，浓度是0.01M；中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）。

根据上述步骤完成免疫荧光实验后，就需要进行荧光显微成像，得到我们想要的结果。选择一款操作简单、成像清晰、效果卓越的荧光显微镜进行观察拍照，才能轻松得到更为理想的结果图，达到事半功倍的效果。

Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜

Echo Revolve正倒置一体荧光显微镜作为一款电动化、智能化的显微镜，具有以下优势：

☑ 正倒置一体快速切换：切片、细胞观察随心切换，无惧任何耗材；

☑ DHR数字降噪功能：极大地降低了背景噪音和荧光干扰，提高图像锐度，加深细节，得到分辨率更高的图片；

☑ 强大的Z-Stacking功能：通过高精度电动化Z轴层扫来扩大景深，解决厚样本观察问题，提高图像分辨率；

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☑ 多通道荧光自动拍摄叠加功能：可自动进行多通道成像的叠加，个性化选择查看/保存各通道的组合图像。