6种脂溶性维生素的快速检测方案

维生素是维持人体生命活动所必需的一类营养物质，大多数由食物供给，属于人体内的一类调节物质。维生素分为水溶维生素和脂溶维生素，脂溶性维生素是不溶于水而溶于脂类的一类维生素，在人体生长、代谢、发育过程中发挥着重要作用，包含维生素A、维生素D、维生素E和维生素K。

VD在肝脏可转化为25羟基维生素D(25OH-VD)，其浓度水平与体内的VD直接相关，因此体内25OH-VD2、25OH-VD3可作为检测VD水平的生物标志物。VK是激活凝血因子以及蛋白质C和S的必须辅助因子，目前已知主要有K1、K2、K3、K4几种形式，四烯甲萘醌VK2(MK4)既是VK2的家族成员，也是肝外组织中K1的代谢物。当这些脂溶性维生素缺乏或过量时均会对人体造成伤害。具体见下表：

一次性评估体内多种维生素水平，才能全面“查漏补缺”。准确测定人体中性维生素的含量，可以帮助临床医生准确评估人体维生素营养状态、吸收障碍或毒性水平。

解决方案

沃特世团队依托质谱平台ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-S IVD和 TQ-XS IVD开发了超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术在维生素检测中的应用，在5 min内即可完成6种脂溶性维生素的同时分析。前处理采用Andrew Alliance机器人搭配Oasis μElution PRiME HLB的固相萃取板，实现样本前处理自动化，并解决LC-MS/MS检测维生素的各种挑战和难点。该方法检出限低、分离效果好、稳定性佳，可满足临床高通量自动化检测需求。

图1. Andrew+移液机器人用于6种脂溶性维生素前处理操作时的工作台布局，以及ACQUITY UPLC I-Class Xevo TQ-XS IVD检测平台。

实验部分

 前处理

• 样本预处理：取100 μL 血清或者BSA稀释标准品，加入内标工作液，涡旋混匀，随后加入乙腈沉淀蛋白，离心取上清液，做SPE净化。

 液相色谱条件

• 液相色谱系统：ACQUITY UPLC I-Class系统
  

• 色谱柱：ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱, 1.7 μm，2.1 mm x 50 mm

• 进样体积：5 μL

结果与讨论

 高通量，一针进样，同时检测

该方案5 min内即可完成6种脂溶性维生素的同时测定，可同时检测血清中维生素A(VA)、25-羟基维生素D2(25OHVD2)、25-羟基维生素D3(25OHVD3)、维生素E(VE)、维生素K1(VK1)、四烯甲萘醌K2(VK2-MK-4)，真正实现“一针进样，同时检测”。

图2. 6种脂溶性维生素的标准品和血清色谱图。

 灵敏度高，线性范围宽，满足临床检测需求

正常人体血清中维生素A含量113 - 977 ng/mL；维生素E含量3.8 - 17 μg/mL；维生素D含量20 - 50 ng/mL；维生素K1含量为0.10 - 2.20 ng/mL。由于6种脂溶性维生素在血清中含量差异较大，VK1、MK4和25OH-VD2含量低，同时测定高低浓度物质是串联质谱测定的难点，常存在低浓度、灵敏度差及高浓度过饱和现象。而Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD优异的灵敏度及超宽线性范围，可实现同时准确定量这几种维生素。

自动化前处理，满足高通量检测需求

Andrew+机器人可在无人值守状态下自动完成移液、震荡、混匀和96孔板SPE前处理过程。不仅大幅节省了样品处理的时间，提高了通量，还可以简化样品制备过程、减少实验失误，从而确保分析结果的稳定重现。手动前处理96个样本的时间大概是2 - 3 h。如果用Andrew+做自动化前处理，只需要提前把溶剂和样本放到设置好的Domino blocks里中就可以完成自动化前处理和SPE流程。过程仅需不到1 h就可以完成。

结论

本方案使用Waters UPLC I-Class超高效液相色谱系统搭载UPLC色谱柱进行分离，再用Xevo TQ-S IVD和TQ-XS IVD串联四极杆质谱仪对血清样品中6种脂溶性维生素定量检测。96个样本的前处理不到1 h，每个样本的液相分析时间仅5 min，每天可以检测至少200例样本。6个脂溶性维生素的加标回收率85% - 115%之间，精密度RSD<8%，保证该方法检测样品的准确性和可靠性，可适用于临床高通量、自动化的样品检测。

       2019年底，新型冠状病毒(SARS-CoV-2)肆虐，它的出现及其在世界范围内的广泛传播引发科技工作者对ZL新型冠状病毒肺炎(COVID-19)药物的广泛关注。鉴于COVID-19的高传播性，并且目前尚没有疫苗对其进行有效预防，研发ZL该肺炎的药物就变得尤为重要。Z近，瑞德西韦、磷酸氯喹和法匹拉韦等多种药物已被证明在抗击COVID-19方面具有潜在活性。

       迪马科技一直致力于为药物研发和检测提供强有力的技术支持，针对抗COVID-19药物检测，迪马科技技术人员开发了一种快速LC-MS/MS方法。应用该方法可以同时快速测定6种潜在ZL药物。本方法选用Endeavorsil^® 1.8 μm C18色谱柱，在4.5分钟内即可完成6种药物的同时检测。方法具有简单、快速等优点。可以预期，该方法的应用必将使得这些潜在药物的检测变得更加方便、GX，并有助于抗COVID-19药物的进一步研究和检测。

       六种化合物的分子结构如下：

瑞德西韦

磷酸氯喹

法匹拉韦

洛匹那韦

沙奎那韦

利托那韦

1、适用范围

       本方法适用于瑞德西韦、磷酸氯喹、法匹拉韦、洛匹那韦、沙奎那韦、利托那韦6种潜在ZLCOVID-19药物的检测。

2、标准溶液的配制

       单标储备液：磷酸氯喹溶于甲醇:水(1:1 v/v)混合溶液中，瑞德西韦、法匹拉韦、洛匹那韦、沙奎那韦、利托那韦溶于甲醇溶液中。

       单标中间液：将各单标储备液配置成4 mg/mL的中间液，稀释液为甲醇。

       混合标准工作液：各单标浓度见表一，稀释液为流动相。

3、色谱条件

       色谱柱：Endeavorsil^® 1.8 μm C18, 100 × 2.1 mm(Cat＃: 87003)

       液相系统：Agilent 1290 Infinity UPLC、AB SCIEX 4000 + MS

       流动相：A:0.1％甲酸水溶液   B:0.1％甲酸乙腈溶液 

       流速：0.2 mL/min  

       进样量：1 μL

       温度：30 ℃

       扫描方式：ESI +

       梯度设置：

4、检测结果

图1六种化合物检测TIC图

图2 六种化合物标准溶液的MRM色谱图

表1六种化合物检测参数和结果

       利用Endeavorsil^® 1.8 μm C18色谱柱，6种潜在ZLCOVID-19药物能够在4.5分钟内实现完全分离 (图1)。表1列出了洗脱顺序、样品浓度、保留时间、离子对信息。

5、结论

　　本文提供了一种有效的同时检测6种潜在ZLCOVID-19药物的方法，其优点包括：流动相简单、分析速度快、灵敏度高和色谱峰形良好。据检索，本方法为国内外shou次利用LC-MS/MS同时分离、测试和确证6种潜在ZLCOVID-19药物的检测方法。迪马科技希望本方法能够为COVID-19ZL药物在研发、生产以及临床试验等阶段的常规测试中提供强有力的技术支持。

６、相关产品信息

       LC-MS/MS法同时测定6种潜在ZL新型冠状病毒肺炎药物相关产品信息：

现行使用的2020年版药典中，对于黄曲霉毒素的检测有明确要求，现检测品种由2015年药典要求的19种中药材增加到25种中药材原料，及用这些原料制成的饮片、丸剂等成品药，现有2020年版药典中对于黄曲霉的检测方法有三种，第一种是高效液相色谱法+光化学衍生法；第二种是高效液相色谱-串联质谱法；第三种是酶联免疫法。现在大部分药检所机构及中药企业实验室基本采用第一种方法居多，不管是从检测复杂程度、设备成本、耗材成本多方面考虑，第一法都有一定的优势。我们公司可以提供第一法的解决方案，并给国内100+中药企业提供过解决方案，如需要解决方案的可与我们沟通联系。

现行药典方法都是化验室用来定量检测的，从样品前处理到得到结果，最快也需要3小时以上，而这是样品已经入库，对于黄曲霉风险比较高的样品，例如酸枣仁、柏子仁、远志等中药材，如果已经入库后，且黄曲霉超标，该样品将无法进入到生产环节，这样对于企业的经济损失将是非常大的，那就急需要一种能现场快速检测黄曲霉的设备，并且结果有保证的检测方法。

中检维康生物公司提供一套现场快速检测中药材黄曲霉的方案，基于胶体金免疫层析快速检测技术（GICA）通过图像分析技术定量快速检测中药材中黄曲霉毒素B1、黄曲霉毒素总量、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮，以及赭曲霉毒素A等真菌毒素的含量。