清洁验证：微生物总有机碳回收率和线性

简介 

       在生产消费品时，有效地清洁生产设备对质量控制 来说至关重要。清洁工艺的目标是降低产品污染的 风险，有效的清洁工艺可以将风险降低到可接受的 水平，以确保产品质量。如果无法衡量和验证清洁 工艺的有效性，就无法了解产品质量和消费者安全 的风险。 

       根据美国食品和药品管理局（FDA）提供的数据， 2017 年食品和饮料行业产品召回的主要原因是微 生物对产品的污染。对于减少和消除微生物污染来说，强有力的清洁工艺至关重要，因此监控清洁工 艺有效性的方法同样至关重要。  

       总有机碳（TOC）分析是消费品生产商广泛采用的非专属方法，用于检测产品、清洁剂、以及微生物 等污染物的残留量。 

       为了证明 TOC 分析法适用于预期用途，我们对设 备清洁之后可能尚存的残留物进行了回收和线性研究。工厂通常会测试化学污染物和化合物，但很少用 TOC 分析法来测试微生物的回收率。本文旨在探讨对于清洁验证和确认，TOC 分析法能否证明 可接受的微生物污染回收率和线性。

实验设计和设置 

       我们同科罗拉多大学博尔德分校合作，用一整夜时 间在胰酶大豆肉汤中培养 100 毫升枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis）。以 4500 转/分钟的速度将Z 终培养物的十毫升等分试样离心分离 10 分钟，形 成细胞沉淀。 在每次离心之间，倒出上面的液体，用涡旋混合方 法用 10 毫升超纯水使沉淀细胞重新悬浮。重复此 过程 7 次。设计淋洗循环以除去细胞培养基带来的 TOC 污染。在第 7 次淋洗循环后，根据已有的 4,6- 二氨基 -2- 苯 基 吲 哚 （ 4,6-diaminidino-2-phenylindole，DAPI）染色任务来对细胞进行重 新悬浮、稀释、计数（见图 1）。 

       确定细胞密度之后，用 Sievers* M9 TOC 分析仪 测量 1 ppm 确认标样组，然后进行三次细胞浓度 稀释。在测量 TOC 之后，用 0.45μm 灭菌过滤器 过滤剩余样品，彻底除去细菌（见图 2）。然后 再次测量 TOC 以确定每个样品的非细胞背景 TOC（见图 2）。

图 1： 枯草芽孢杆菌在细胞计数的荧光显微镜成像

图 2：枯草芽孢杆菌的过滤过程

结果

表 1：微生物细胞密度与 TOC 的相关性结果

       表 1 和图 3 是微生物 TOC 相关性研究的结果。线性趋势线的 R2 值为 0.9981，表明实测细胞密度有良好的线性趋势。根据图 3 所示的线性拟合趋势线方程，定义为 3 倍噪声的检测水平（LOD，Level  of Detection）为 2.74E + 06 细胞/mL。此外，根据线性拟合趋势线和 M9 仪器规格，50 ppm 的Z 大仪器定量限为 2.49E + 08 细胞/mL。 

       在进行微生物 TOC 定量之后，分别将 1 毫升的每 种细胞密度溶液放在不锈钢试样板上进行试样污染， 然后使试样干燥。此试样污染的目的是确定微生物 TOC 相关结果的目视检测限。图 4 是微生物试样 污染图。

图 3：微生物细胞密度与 TOC 的线性关系

图 4：微生物试样板污染 (A) 5.8E+07 细胞/mL (B) 5.8E+06 细胞/mL (C) 5.8E+05 细胞/mL

讨论与结论

       微生物 TOC 相关结果和试样污染图都说明了连续 监测已有的清洁工艺有效性的重要性。在理想光线 下，很容易在试样板上看到Z 高细胞密度（5.8E +  07 细胞/mL）的污染斑。而对于较低细胞密度， 即使光线很好，也很难在试样板上看到污染斑。这表明除了强有力的清洁工艺之外，还需要用非目测的方法来测试清洁工艺的有效性。 

       根据收集的数据，可以想象用于生产消费品的设备上仍有显着微生物污染，却仅凭目视检查就被投放 到生产中，导致严重后果。因此必须连续监测已有 的清洁工艺的有效性，才能降低产品质量风险和消 费者安全风险。 

       Z 后，由于微生物分子组成的不确定性，很难确定微生物溶液的回收率。本研究根据先前在确定活性 微生物细胞中的碳含量时的发现，旨在确定微生物 溶液的理论回收率。图 5 是理论微生物 TOC 产出 量的计算过程。基于每个细胞的碳原子参考数， 5.8E + 07 细胞/mL 的理论 TOC 浓度为 11.6 ppm。

图 5：理论微生物 TOC 产出量的维度分析

      在本文的实验中，测量到 5.8E + 07 细胞/mL 的 TOC 实际回收值为 9.13 ppm，对挑战性的化合 物的回收率为 78.7％，从而证明实验方法是成功的。 

       总之，本研究用 Sievers M9 TOC 分析仪演示了 在清洁验证和确认时的细胞密度同目视检测限的 关系，成功地证实了微生物 TOC 回收率。实验 数据支持使用 Sievers TOC 分析仪来确认设备清 洁度，同时表明除了目视检查之外还须考虑使用 监测微生物污染的定量方法。 TOC 分析法是测 量残留物、监测清洁工艺、降低总体风险的有效 方法。苏伊士公司提供 Sievers 系列产品，包括 能够解决您的一切清洁验证和确认需求的 TOC 解决方案、服务、支持。

目的

       为表明Sievers* 总有机碳（TOC）分析仪，对具有高分子量与复杂化学结构的化合物的回收能力，本研究中的这些化合物，通常被认为难于被非燃烧/红外检测的TOC仪器氧化并准确检测。

结论

        Sievers  TOC分析仪回收标准溶液中这些化合物的能力非常好。牛血清白蛋白（BSA）、头孢他啶（CP） 、葡聚糖硫酸酯（DS ） 、牛血红蛋白（Heme）和人胰岛素（HI），以平均95％被回收。本研究为清洁验证的非专属但高度灵敏的TOC分析方法提供支持，特别是本案例中的UV/过硫酸盐方法。此应用具有巨大的价值，因为与其他方法相比，该技术具有低水平的检测限（ppb）、分析时间快并且操作成本低。

讨论

       国际医药科技协会（PDA）列出了用于验证和监控清洁的许多合适的物理、化学和生物技术，其中包括针对特殊分子的试验以及许多非特定试验。在查看性能比较和参考之后，PDA特别提到，“典型的清洁验证研究可使用pH、电导率、总有机碳、洗涤剂试验，若有多产品设备，则使用产品专用的试验。”应比较分析的精度、准确度、检测限、定量限、选择性、线性、范围和灵敏度。进行了许多科学研究以评测性能，比如符合的通用方法：高性能液相色谱（HPLC）、薄层色谱（TLC）、UV光谱、总有机碳（ TOC ） 、酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、胶体电泳和电导率等常用方法。药物残留、赋形剂、清洗剂残留和反应副产物都显示了该方法的优点和缺点。

       仔细选择清洁验证（CV）分析的仪器应是任何清洁验证主计划实施的一部分。TOC的使用，应该是仅有的几种类型 之一，以其氧化方式不同为特点。可使用燃烧炉、加热的过硫酸盐溶液或者紫外灯存在下的过硫酸盐溶液进行氧化。Sievers Model 使用UV/过硫酸盐氧化方法，并使用其ZL膜电导测量技术测定清洁验证样品的TOC浓度。

       本研究检验牛血清白蛋白（BSA）、头孢他啶（CP） 、葡聚糖硫酸酯（DS ） 、牛血红蛋白（Heme）和人胰岛素（HI）在多种浓度下的回收率。表1所示为回收数据一览表。

表1.牛血红蛋白(Heme)、牛血清白蛋白( BSA)、头孢他啶（CP）、葡聚糖硫酸酯(DS) 和人胰岛素(HI)

       所研究化合物的平均回收率为95.9％，范围在73％至129％之间。化合物回收率很好且在预料之中，然而葡聚糖硫酸酯的回收率范围在118％至131％之间。 在此研究时，还不清楚这么高回收率的引起原因，但对化合物进行进一步查看，以便找到可能的解释。值得注意的是，葡聚糖硫酸酯以及其他的所有化合物的回收率线性在浓度范围内非常好。这使得可通过应用相关的曲线方程方便地预测未知浓度的样品。图1是包含各化合物线性的图，而各公式在表2中。所研究各化合物的线性非常好。

图1：BSA、CP、DS、Heme和HI的线性总结

表2 BSA、CP、DS、Heme和HI的线性总结

小结

       当进行回收这组生物医药行业常用的大分子时，Sievers TOC分析仪进行得很好。表明UV/过硫酸盐法可用于将化合物中所含的碳氧化为CO2，进行量化。 许多医药相关的设备已经成为非特定但高灵敏度TOC分析仪用于清洁验证的很好案例，请注意与其他方法相比，该技术检测含量低（ppb）、分析时间快并且成本低，而且可检测众多碳基残留。

材料和技术

试剂

1. 6M的磷酸溶液

在含有1L低TOC水的5L容量瓶中加入2 L 85％的磷酸，并用低TOC水稀释到体积刻度。

2. 15％过硫酸铵溶液

在5L低TOC水中溶解750 g过硫酸铵。

3. 低TOC水。

材料

1. 牛血清白蛋白（BSA）：Fluka已测定@54.45%碳。

2. 人胰岛素（HI）：Fluka已测定@44.1%碳。

3. 头孢他啶（CP）：SmithKline Beecham已测定@41.5%碳。

4. 葡聚糖硫酸酯（DS）：Aldrich已测定@18.56 %碳。

5. 牛血红蛋白（Heme）：Aldrich已测定@49.87 %碳。

6. 容量瓶和移液管（使用稀释的Steris CIP 100™溶液清洗并使用20 次低TOC 水漂洗）。

仪器

1．Sievers 总有机碳分析仪

2．Sievers TOC 自动进样器

参考资料

✦1. Agalloco J. “Points to consider in the Validation of Equipment Cleaning Procedures,”（设备清洁步骤验证中的注意点），J. Parenteral Sci. Tech., 46 (5): 163-168, (1992) Cooper D. W., Cleaning Aseptic Fill Areas,. Pharm. Technol. 20(2): 52-60 (1996)

✦2. Dolch G., Baffi R., Garnick R., Huang Y. F., Mar B., Matsuhiro D., Niepelt B., Parra C., Stephan M., “A Total Organic Carbon Analysis Method for Validating Cleaning Between Products in Biopharmaceutical Manufacturing,”（用于生物医药生产中清洁验证的总有机分析方法），J. Parenteral Sci. Tech.,45 (1): 13-19, (1991)

✦3. FDA Guide to Inspections of Validation of Cleaning Processes（清洁验证步骤检查的FDA指南），July 1993, p. 8.

✦4. Godec R., Kosenka P., Hutte R., “Method and Apparatus for the Determination of Dissolved Carbon in Water,”（水中溶解碳测定的方法和器械），U.S. Patent No. 5,132,094 (July 21, 1992)

✦5. Harder S. W., “The Validation of Cleaning Procedures,”（清洁步骤的验证），Pharm. Technol., 8 (5), 29-34 (1984)

✦6. Jenkins K. M., and Vanderweilen A. J., “Cleaning Validation: An Overall Perspective,”（清洁验证：全面观察），Pharm. Technol., 18 (4), 60-74, (1994).

✦7. Parenteral Drug Association, Cleaning and Cleaning Validation: A Biotechnology Perspective（非肠道药物协会，清洁和清洁验证：生物技术展望），PDA, Bethesda, MD, 1996

✦8. Smith J. M., “Selecting Analytical Methods to Detect Residue from Cleaning Compounds in Validated Process Systems,”（选择分析方法以检测来自验证的工艺系统中清洗化合物的残留），Pharm. Technol., 17 (6), 88-98 (1993)

01 简介

清洁验证研究和持续的清洁周期监控都需要使用TOC浓度低且稳定的样品瓶来进行灵敏度和可靠性高的擦拭和淋洗样品分析。使用TOC浓度较高且差异较大的清洁验证套装，会增加失败的风险，从而不得不进行额外清洁，或者做出不准确的设备清洁度评估，导致代价高昂甚至危险的后果。

本文评估以下两种不同的清洁验证套装，均包括低TOC棉签和TOC样品瓶:

1. 苏伊士公司的Sievers^®清洁验证套装

2. Texwipe* TX3342 TOC清洁验证批量套装

02 评估

本文评估各供应商的清洁验证套装的基准TOC贡献和差异。在测试中，我们分析了各供应商的两个批次的棉签(每批次12个棉签)，棉签均装在40毫升超纯水的样品瓶中(每个供应商提供12个样品瓶)。两种清洁验证套装均使用Texwipe棉签。

03 基准TOC结果

04 结论和建议

本文中的数据显示，测试的两个批次的Sievers清洁验证套装的背景TOC都比较低而且稳定。此外，在同一批次内，Sievers套装的浓度差异较小(Sievers的两个批次的标准偏差分别为3.3和3.4ppb，Texwipe的同两个批次的标准偏差分别为4.0和6.3ppb)。在不同批次之间，Sievers套装的浓度差异也较小。由于Sievers套装的背景TOC低而且差异小，因而更能提供灵敏而精确的清洁数据。Sievers的高品质保证和样品瓶的完全可追溯性为准确而完整的分析提供了强有力的保障。

在进行清洁验证时，Sievers认证的样品瓶、清洁验证套装、预酸化样品瓶都具有出众的性能和稳定性。如果您需要使用酸化擦拭样品，比如用来回收蛋白质或肽，Sievers给您提供装有酸化水的预酸化样品瓶。无论您是要回收常规化合物还是难以回收的化合物，Sievers认证的和专用的TOC样品瓶都能帮助您完成极其准确的分析。

*Illinois Tool Works Inc的商标

在现代的科学研究、生产和实验室工作中，洁净度和准确性至关重要。针对TOC(总有机碳)验证的特殊需求，美迪科推出了TOC清洁验证棉签MPS-713。这款棉签具有极强的耐磨性和锁紧性能，为清洁验证工作提供了极大的便利和可靠性。

　　该棉签的特点之一是其洁净室水洗设计。它采用双层针织涤纶材料制成，不含硅、氨和邻苯二甲酸二辛酯(DOP)，确保了高度的洁净度。无论是微生物取样还是纯化水的TOC取样，这款棉签都是专门为清洁验证而设计的，可满足各种验证要求。

　　手柄采用浅绿色的聚丙烯材料制成，具有良好的耐化学性和抗溶剂锁紧能力。同时，手柄设计合理，易于折断，方便取样后的处理和保存。热粘合头的设计使棉签柔软无磨损，并且具有超低的不挥发物残留和低颗粒纤维生成，确保了取样的准确性和可靠性。

　　除了优异的性能特点，美迪科TOC清洁验证棉签还注重产品的生产工艺和包装环节。它在100级洁净区内进行全程生产和包装，极大地降低了发尘量，确保了产品的洁净度。

　　美迪科TOC清洁验证棉签的结构特点也非常值得一提。它的清洁头采用针织涤纶材质制成，具有干净耐磨的特性，可用于清洁验证工作的各个环节。拭子手柄采用刚性设计，并配备大型内部头部桨叶，提供了坚实的支撑，使棉签在使用过程中更加稳定和可靠。手柄还带有折断点，方便处理和保存样本，增加了工作效率。

　　综上所述，美迪科TOC清洁验证棉签MPS-713是一款针对清洁验证工作而设计的专用棉签，具有强的耐磨性和锁紧性能。它采用洁净室水洗设计，不含有害物质，拥有良好的耐化学性和溶剂锁紧能力。该棉签在生产工艺和包装环节也经过精心设计，确保产品的洁净度。无论是用于微生物取样还是TOC取样，美迪科TOC清洁验证棉签都是您可靠的选择。

简介
       清洁验证是一个需要具有完备证明文件的过程，证明制药行业生产设备的清洁是有效的和一致的。清洁验证策略的必要性已经要求去寻找一个定量的、精确的方法，确定制药生产过程中的污染物或者清洁残渣是否存在。
测试方法
       当前有两种清洁验证方法需要采用 TOC 分析：棉签技术和清洗水技术。下面是这两个方法的主要叙述。
棉签技术
       棉签技术需要一些棉花，聚酯、聚亚安酯或者 Teflon^®的棉签，采集制药生产罐内部某些区域的样品。这些区域可以是罐的内壁，也可以是一个称作“试样” 的小板（在生产过程中，这个小板悬浮在产品的表面，作为生产用罐清洁和清洗程度的标志物）。棉签放置于要采样的表面，擦拭整个样品表面。 擦拭的方向和压力在清洁标准操作规程（SOP）中作了定义。然后萃取这个采样过的棉签。将棉签放入一个装有酸性溶液的小瓶中，然后执行超声波或者离心处理，Z后分析此酸性溶液的 TOC 浓度。
       也可以通过将棉签放入一个密封的、装有 5%磷酸和 100 克/升过硫酸钠溶液的玻璃安瓿瓶中，之后分析这个棉签浸取液。无机碳形式的二氧化碳被吹扫到环境中，然后密封这个玻璃瓶。玻璃瓶被加热到100℃并保存指定的时间。Z终，打开玻璃瓶， TOC 以二氧化碳的形式被吹出并进行检测。
清洗水方法
       这个过程包括：在产品生产之前分析取自设备的清洗水，然后在清洁和清洗了生产设备之后再次分析这个清洗水。比较两次的分析结果以证实设备的清洁度。
清洁验证中TOC分析的优势
       TOC 分析具有检测原材料、生物制品、清洗物质、清洁剂和其它有机污染物等很多应用场合。 TOC的结果是重复的以及定量的，并且不会受到特定物质的干扰。这使 TOC 的结果能够被快速地进行准确无误的验证。
结论
       通过快速和准确的分析， TOC 分析仪能够检测制药行业生产水中大量的有机污染物。在 TOC 分析的广泛的应用中，OST 和清洁验证只是其中的两项应用。随着法规条例的不断补充， TOC 分析像其它方法和技术一样，其重要性将不断地提高。虽然如此，需要做更多的研究，使 TOC 的分析在制药行业发挥Z大的效率。

确定最适合您的机会和挑战

制药企业不断面临进行清洁验证的挑战。以下是确保实施成功、合规清洁验证的五种方法。

01  为您的清洁程序确定合适的技术和最有效的部署方案（实验室、在线、旁线）

了解您的清洁过程。为清洁过程选择正确的技术是成功实施清洁验证的关键。对于清洁验证，有许多常用的分析方法。

 专属性方法 

如在清洁过程中对特定分析物进行UV/VIS或HPLC试验。尽管可以对目标分析物进行检测并使人们确信目标分析物已经清洗干净，但这些测试无法检测到可能影响产品质量、产量、效能或安全的其它化合物，如降解物或洗涤剂。这种类型的分析仅限于在实验室使用。

 非专属性方法 

如总有机碳TOC分析法，与专属性方法相比，可对清洁度有更全面的了解。TOC法不只是检测一种分析物，而是通过采用一种方法来检测清洁剂、降解物、API和赋形剂。TOC还可根据您的工艺提供多种ZJ部署方案（实验室、在线、旁线）。

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02  简化方法验证和仪器确认

需要进行方法验证和仪器确认，以表明方法参数适当，并且仪器适用于该方法。尽管这些对于清洁程序的成功与否至关重要，但方法验证和仪器确认并不一定非得很复杂。

开发一种合适的方法来提供充分的化合物回收率、线性、稳固性和专属性数据，并设定合适的接受标准。重要的是要证明这些分析数据满足要求，并确保所选择的技术能够满足可靠的方法开发需求。方法开发和验证应本着实用性、可实现、可验证并具有说服性原则。

对仪器进行全面确认，以验证仪器的安装、操作和性能满足其预定的用途要求。一些仪器制造商会提供相关文件和服务来协助您全面完成仪器确认工作。

03  选择ZJ消耗品，以实现ZJ回收率和样品可靠性

样品瓶和标准品等消耗品会对分析方法的成败产生极大影响。请确保您为清洁工艺选择可追溯、合规和和合适的消耗品。

应该定期对系统进行挑战，以确保方法的适用性。选择浓度合适的一种或多种化合物，以反映您的清洁工艺，并且对清洁验证使用的仪器进行适当的挑战。

一些供应商会提供特殊消耗品，以提高验证方法成功实施的概率。例如，如果您的工艺涉及到蛋白质检测，则对TOC样品瓶进行预先酸化可大大提高经常被漏报的粘性蛋白质的回收率。在开发检测方法时，请考虑此类解决方案。

在线分析相较于实验室分析，可以降低使用样品瓶的成本并提高样品的可靠性。自动化分析在一定程度上消除了取样误差，同时节省了金钱和时间。

04  利用数据来控制、深入了解和优化清洁工艺

选择能够生成可信、可验证并用于故障排除和重要CGMP决策数据的技术。如果数据没有经过验证且不准确，就很难深入了解和控制清洁工艺。

拥有准确的数据可以使人们对结果充满信心，并以此做出重大质量决策。如果采用TOC，在选择具体TOC技术进行清洁验证时应格外小心，因为某些技术不适合用于精确分离和检测。

TOC分析仪提供了可以洞悉清洁工艺的三个单独的数据，以ZZ实现对清洁工艺的控制、深入了解和优化。一个样品分析可以给出无机碳、总有机碳和电导率数据。通过这些数据可用于确定清洁工艺失败的根本原因，采取纠正和预防措施或优化清洁周期。

05  数据可靠性

在CGMP设置中，数据可靠性比以往任何时候都重要，在清洁验证中实施分析技术时必须考虑数据可靠性。

FDA已经对采用相关分析方法时不遵守数据可靠性标准多次发出了警告函。具体来说，当采用HPLC时，常见的问题是没有对峰值进行积分或没有对鬼峰产生的原因进行调查。在清洁验证中出现未知峰不可避免，但必须对其进行彻底调查并记录。

使用TOC进行清洁验证不仅可以全面了解清洁度，并且一些分析仪还完全符合21 CFR 第11部分规定的要求和数据可靠性准则。数据应保存在安全的数据库中，能够随时访问，所有工作均应保存在安全审核记录中。在利用数据做出重要质量决策时，需要制定和实施强有力的程序来保证数据的可靠性和安全性。

当采用在线TOC分析进行清洁验证时，由于不存在数据转录、打印和未验证数据传输的环节，因此具有更高的数据安全性和可靠性。