培养基分析和细胞培养过程监控液质联用系统

近十年来，生物医药产业蓬勃发展，国内外市场规模仍保持高速增长。除了治 疗性蛋白药物，疫苗产业也在不断升级和创新，新冠疫情是全 球疫苗产业发展的助推剂，引发了新一轮的爆发式增长。此外，基因和细胞治 疗全 球发展迅速，定将是生物医药领域未来十年一个重要的发展方向。

细胞培养是生物医药产业的核心环节之一，贯彻生物医药研发和生产的全生命周期。无论是蛋白药物的 CHO 细胞、疫苗的 Vero 细胞，还是细胞治 疗的 CAR-T 细胞，培养基和培养工艺条件都是细胞培养过程的关键要素。培养基是“一个包含无机盐、糖、氨基酸和维生素以及其他必须营养物质的等渗透压且具有 pH 缓冲能力的混合物”，给细胞生长提供微环境和营养物质。不同的细胞具有不同的特征，用于培养它们的培养基组成应与细胞的要求相匹配，不合适的培养基会影响细胞的生长状态和功能。

另外，培养基营养成分的消耗以及代谢废物毒物的积累，也与细胞功能和蛋白的表达密切相关。因此，定期监测糖、代谢物、维生素、氨基酸和代谢物等的变化，以优化补料策略以及收获时间，并同时选择合适的细胞培养基，这些对于提高细胞密度和活率，最 大限度地提高蛋白产量，确保蛋白质量是非常重要的。此外，除了监测培养环境中营养物质和代谢产物的变化，也需要对细胞本身做更深度的研究，细胞的“生老病死”、蛋白的表达都是细胞功能和代谢的结果。不管是培养基设计，还是培养工艺优化，都离不开这些研究。

因此，无论是生物制药公司，还是培养基生产商，只要涉及细胞培养，都需要开发培养基成分和细胞代谢物与功能的监测方法。传统的培养基分析，检测流程过于复杂，主要是对葡萄糖、氨基酸和维生素等进行分析，其他很多成分不进行检测；而且不同类型的成分用不同的样品处理和分析方法，分析时间长，成本高，这种检测流程已不能满足工业快速、标准化的要求。而液质联用技术因其具有高通量、专属性强和准确度高等特点，使其能够很好的解决普通检测流程出现的问题。另外，对于细胞本身的监测，目前大家主要关注的是生长密度、活率、倍增时间等细胞状态的变化，对于细胞功能本身的深层次的分析还比较少。通过 Seahorse 和高分辨质谱等技术, 综合细胞功能和分子代谢物水平对细胞代谢做全面研究。

安捷伦和测简奕共同开发的细胞培养基和代谢分析完整解决方案，包括培养基原料分析、培养基成分消耗监测和细胞代谢研究等，为细胞培养提供全面的质量控制和深度研究，为培养基和培养工艺开发和优化指明方向。

培养基成分消耗和代谢物监测

有机物分析

培养基营养成分消耗和代谢物的积累，是细胞培养工艺开发关注的重 点。方案中的 LC QQQ 技术平台可以定量监测 151 种化合物的消耗或者产生，包括氨基酸、维生素、核苷类、胺类、有机酸、糖类和脂类以及这些化合物的衍生物。方案方法包中有其中 80 种化合物的混合标准品，可以对这 80 种化合物的绝 对含量进行检测。有了精 准监测的数据，可以实现精 准补料，确认补料的化合物种类、浓度以及时间点；也可以针对产生的代谢毒废物情况，及时调整工艺参数或者加入中和物质，降低毒废物对于细胞本身以及蛋白产量质量的影响。

可监测的 151 种化合物列表如下：

可绝 对定量的 80 种化合物的定量限、线性范围数据如下：

Agilent 6470 三重四极杆液质联用系统

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元素分析

随着细胞培养基配方变得越来越复杂，生物制药领域对于培养基中原物料的关注度也越来越高，其中对培养基中元素变化进行表征显得尤为重要，主要是因为元素对于工艺的潜在影响。

安捷伦快速智能的 ICP-OES 和超高信噪比的 ICP-MS，智能定量（IntelliQuant）平台可以快速对于不同培养基中的全元素进行扫描，提供的专属热力图，可以帮助实验人员更加直观的对培养基中元素差异进行辨别；全能高效的 ICP-MS 方案标配高基体引入系统（HMI），耐受盐分含量较高的培养基，兼顾高效和准确性，可以更好保证符合培养基以及抗体，疫苗的测试。

全元素快速扫描——助力生物药研究和质量控制

Agilent 5800 ICP-OES 对于未知疫苗样品快速定性和半定量（IntelliQuant）结果，热力图（Heatmap）直观显示疫苗中铝佐剂所有元素浓度高低分布，样品组成便可“一目了然”。

Agilent 7800 ICP-MS IntelliQuant 对培养基样品的全元素扫描热力图直观显示图：

Agilent 7850 ICP-MS 培养基中主量元素分析

Na 元素作为细胞渗透压的一个重要表征；Agilent ICP-MS 可以实现 1% 级别的 Na 元素检测，对于微量元素分析的同时又实现了渗透压的监测。

Na 校正曲线范围：0.1ppm--10000ppm

Agilent 7850 ICP-MS 培养基中痕量元素锰(Mn)，硒(Se)的分析

得益于 Agilent ICP-MS 超高的灵敏度，锰（Mn）的背景等效浓度可以达到 0.4ppt；锰（Mn）是糖基化通路中多种酶的辅助因子，在培养基中如过度的补充会降低蛋白的产量以及抑 制细胞的生长，因此更好的监控锰（Mn）的含量对于细胞的生长有重要的意义。

Agilent 7800 ICP-MS 具有超低浓度锰（Mn）的检出能力，可以更好满足培养基中关键元素锰（Mn）控制要求。

安捷伦独有的增强型 HEHe（High Energy Helium）模式，相对普通 He 模式下硒（Se）的灵敏度提升近五倍，同时背景也降低了一倍多，信噪比提升十倍以上。硒（Se）对细胞培养基具有解 毒的机制，同时作为 Fe 的运载体，对于细胞培养起到举足轻重的作用，无需使用氢或其他反应模式即可分析极 ppt（ng/L）级别的硒，可以更好满足培养基中硒（Se）元素的控制要求。

不同模式下硒（Se）灵敏度对比

安捷伦 7850 ICP-MS 对于培养过程监控

备注：单位：μg/L

备注：单位：μg/L

培养基中微量元素培养过程的含量变化与细胞生长密切相关，很多研究表明 Zn 对于蛋白电荷的变化有起到一定的作用。

培养基原料分析

根据细胞适用性的不同，培养基中的成分及其配比会有差异。入库鉴别需要将不同种类的培养基快速区分出来，以降低由于原料标签、分类等错误而导致的误投料风险。

拉曼光谱仪广泛应用于原辅料入库鉴别。安捷伦 Vaya 手持拉曼光谱仪性能出众，具备优异的光谱信噪比，同时搭配 R2 和 LMC 智能算法，能够有效鉴别不同培养基。下面案例用 1 号培养基建模，建立的模型分别测试了 1-9 号培养基样品， 1 号和 4 号培养基相同， 1 号和 2、3、5、6、7、8、9 号培养基不相同。1 号和 4 号测试结果为“Pass”，其他样品为“Fail”，与预期一致。

1-9 号培养基测试结果汇总如下：

2 号培养基（测试结果为 Fail）的测试图谱如下，其中紫色为模型图谱，蓝色为 2 号培养基图谱。

此外，一般培养基在受热、吸潮后，易被细菌污染或分解变质，因此培养基必须防潮、避光、阴凉处保存。常见的固体培养基一般是装在桶中，内层有两层 PE 袋包装，也有一些直接装在不透明的塑料瓶中。对于储存在桶中的培养基，Vaya 可以透过内袋进行测试。对于不透明的塑料瓶， Vaya 可以隔着外包装直接检测。

塑料桶包装固体培养基                          塑料瓶包装固体培养基

结 语

本文介绍了安捷伦-测简奕共同开发的“细胞培养基和代谢分析完整解决方案”，从培养基原料分析、培养基成分消耗和代谢物监测以及细胞代谢研究等不同维度和水平，全方面研究和控制细胞培养过程。