GE给您完全的蛋白印迹方案--Western Blot相关产品秋季开学特惠

本文由 Cytiva（思拓凡） 整理汇编

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• GE给您完全的蛋白印迹方案--Western Blot相关产品秋季开学特惠

  GE给您完全的蛋白印迹方案--Western Blot相关产品秋季开学特惠[详细]

  2012-09-05 00:00

  专利

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• 你的Western blotting实验好拍档——GE明星产品组合大特惠

  你的Western blotting实验好拍档——GE明星产品组合大特惠[详细]

  2013-04-01 00:00

  选购指南

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• 蛋白质印迹分析（Western Blot Analysis）

  蛋白质印迹分析（WesternBlotAnalysis）【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。常用的两种电转移方法分别为:1.半干法:凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。【实验操作】⒈.蛋白质的分离根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。⒉.电转移⑴准备PVDF膜根据胶的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小应略微小于胶的大小。将膜置于甲醇中浸泡1分钟，再移至转移缓冲溶液中待用。夹心放置顺序⑵制作胶膜夹心在一浅盘中打开转移盒，将一个预先用转移缓冲溶液浸泡过的海绵垫放在转移盒的黑色筛孔板上，在海绵垫的上方放置经转移缓冲溶液浸湿的3MM纸，小心地将胶板放在3MM纸上，并注意排除气泡。将PVDF膜放在胶的上方同时注意排除气泡，再在膜的上方放上一张同样用转移缓冲溶液浸湿过的3MM纸并赶出气泡，放置另一张浸泡过的海绵垫，关闭转移盒。将转移盒按照正确的方向放入转移槽中，转移盒的黑色筛孔板贴近转移槽的黑色端，转移盒的白色筛孔板贴近转移槽的白色端，填满转移缓冲溶液同时防止出现气泡。⑶电转移连接电源,在4°C条件下维持恒压100v，1小时⒊.免疫检测⑴膜染色断开电源，将转移盒从转移槽中移出，将转移盒的各个部分分开。用镊子将PVDF膜小心放入一个干净的容器中，用TBS缓冲溶液进行短暂清洗，从膜上剪下一条宽约5mm的膜放入另一个干净的容器中。将这条膜在染色液中浸泡1分钟，然后在脱色液中脱色30分钟,确定蛋白质已经转移到PVDF膜上。⑵膜的封闭和清洗对于没有进行染色的膜，首先倒出TBS缓冲溶液,加入3%封闭缓冲溶液,轻轻摇动至少1小时。倒掉3%封闭缓冲溶液，并用TBS缓冲溶液清洗3次,每次5分钟。⑶一抗倒掉TBS缓冲溶液，加入10ml0.5%封闭缓冲溶液及适量的一抗，轻轻摇动1小时以上。从容器中倒出一抗及封闭缓冲溶液，用TTBS缓冲溶液清洗两次，每次10分钟。⑷二抗倒出TTBS缓冲溶液，加入5ml0.5%封闭缓冲溶液及适量的二抗。轻轻摇动30分钟，倒出二抗及封闭缓冲溶液，用TTBS缓冲溶液清洗两次，每次10分钟。⑸检测倒掉TTBS缓冲溶液，并加入显影剂，轻轻摇动PVDF膜，观察显影情况，当能够清晰的看到显色带时，用蒸馏水在30分钟内分三次清洗PVDF膜以终止显色反应的继续进行。【实验结果】检查膜上显色结果，蓝紫色带所对应的即是目标蛋白的位置。WesternBlotAnalysis【Purpose】ComprehendthetheoryofWesternblotting;understanditsbasicmanipulationandapplication.【Principle】WesternblottingisalsocalledImmunoblotting.Itisakindofimmunochemicaltechniqueswhichisusedtodetectaproteinimmobilizedonamatrix.Thetargetproteincanbeinacrudeextractoramorepurifiedpreparationandthemonoclonalorpolyclonalantibodyagainstthisproteinisnecessarytohelpustorecognizetheantigen.AsintheFigure,solubleantigens（thetargetprotein）maybeseparatedbyelectrophoresisbasedonitsmolecularweight（SDS/PAGE）,sizeandcharge（nondenaturatinggelelectrophoresisorisoelectricpoint（isoelectricfocusing）.Aftertheseparation,theproteinsaretransferredfromthegeltoaPVDFmembrane.Onceonthemembraneantibodies（firstantibodies）canbeusedtoprobeforthepresenceofparticularproteinbecauseofthespecificallybindingofantigenwithagainstit.Non-specificbindingsitecanbe“blocked”usingothernon-specificproteinsuchasbovineserumalbuminbeforeaddingfirstantibodytoavoidnon-specificbinding.Proteintransferismostcommonlyaccomplishedbyelectrophoresis，Thisprocedureiscalledelectrophoreticblotting.Thetwocommonelectrophoreticmethodsare:⒈Semi-dryblotting,inwhichthegelandimmobilizingmatrixaresandwichedbetweenbuffer-wettedfilterpapersthroughwhichacurrentisappliedfor10-30minutes.⒉Wet（tank）blotting,inwhichthegel-matrixsandwichissubmergedintransferbufferforelectrophoresis,whichmaytakeaslittleas45minutesormaybeallowedtocontinueovernightWeonlydescribewetblottinghere,sinceitpermitsgreaterflexibilitywithoutbeingsignificantlymoreexpensiveintimeormaterials.Thedetectionoftargetproteinisusingasecondantibody,whichcanrecognizethefirstantibody.Typically,thesecondantibodyispurchasedalreadyconjugatedtoalabe领agentsuchastheenzymehorseradishperoxidase.Thismarkeristhenvisualizedbyacolorimetricreactioncatalyzedbytheenzymewhichyieldsacoloredproductthatremainsfixedtothemembrane.Thus,itispossibletorecognizefirstantibodythroughrecognizingsecondantibody,andthenidentifythepositionoftargetprotein.Otherdetectionsystemsincludealkalinephosphataseand125Ilabels.【Materials】⒈Apparatus:ApparatusofSDS-PAGE,ElectroblottingApparatus,Powersupply,PVDFmembrane（MilliporeImmobion-P#IPVH00010）,Whatman3MMpaper,AdditionalTools:Forceps,spongepad,scissor,gloves,smallplasticorglasscontainer,Shallowtray.⒉Reagents:⑴10xtransferbuffer（1L）:30.3gTrizmabase（0.25M）,144gGlycine（1.92M）,pH首ldbe8.3;withoutadjustment.⑵1xtransferbuffer（2L）:400mlMethanol,200ml10xtransferbuffer,1400mlwater.⑶TBSbuffer:Add1.22gTris（10mM）and8.78gNaCl（150mM）to1LdistilledwaterandadjustpHto7.5withHCl.⑷TTBSbuffer:1LTBSbufferadd0.5mlTween20（0.05%）.⑸Firstantibody:antibodyagainstthetargetprotein.⑹Secondantibody:goatanti-rabbit-HRP（horseradishperoxidase）.⑺3%Blockingbuffer（0.5L）:Add15mgBovineserumalbumininTBSbuffertofinalvolume0.5L,keepat4°Ctopreventbacterialcontamination.⑻0.5%Blockingbuffer（0.5L）:Add2.5mgBovineserumalbumininTBSbuffertofinalvolume0.5L,keepat4°Ctopreventbacterialcontamination.⑼Developingreagent:1mlchlonoaphtholsolution（30mg/mlinmethanol）,add10mlmethanol,addTBSbufferto50mlandadd30ul30%H2O2.⑽Stainingbuffer:Add1gamidoblack18B（0.1%）,250mlisopropanol（25%）and100mlaceticacid（10%）todistilledwaterwithfinalvolume1L.⑾Destainingbuffer:Add350mlisopropanol（35%）and2mlaceticacid（2%）todistilledwaterwithfinalvolume1L.【Procedure】⒈.SeparationofProteinRunanelectrophoreticseparationofknownantigenicproteins.Themethodofseparationdecidedbythecharactersoftargetprotein,butforsufficientlytransferring,themostcommonmethodisSDS-PAGE.Afterseparation,removeuppersideofsamplewellswitharazorblade.Notchingbottomright-handcornerofgelfororientationandputgelintransferbufferuntilreadytouse.⒉.Electrotransfer⑴PreparationofmembraneCutapieceofPVDFmembrane（MilliporeImmobion-P#IPVH00010）accordingtothesizeofgel.Incubateinmethanolforabout1minonarockeratroomtemp.Removemethanolandequilibratemembranein1xtransferbufferuntilreadytouse.⑵Arrangegel-membranesandwichInashallowtray,openthetransfercassette.Putawell-soakedspongepadontheblackpieceofthetransfercassetteandawetted3MMpaperonthespongepad.Placethegelonthepaperandarrangewellsothatallairbubblesareremoved.LaythePVDFmembraneonthetopofgelandremoveanyairbubbles.Placeawettedsheetof3MMpaperoverthePVDFmembraneandremovethebubble.Coveredwiththesecondwell-soakedpad.Closethesandwichwiththewhitepieceofthecassette.Mountthesandwichinthetransfertank;puttheblacksidesneartheblacksideofthedevice.Fillthebuffertankwiththetransferbuffer.⑶Electrotransfer:Attachtheelectrodes.Setthepowersupplyto100V（constantvoltage）for1hat4°C.⒊.Immunodetection⑴MembranestainingDisconnecttransferapparatus,removetransfercassette,andpeel3MMpaperfrommembrane.Removethemembranetoasmallcontainer.Add10mlTBSbufferandwashforshorttime.Cutoutonestripewith5mmwidthandputinanothercleancontainer.Stainthisstripeinstainingbufferfor1min.Destainfor30minindestainingbuffertocheckwhetherproteinhasbeentransferredfromgeltomembraneornot.⑵MembraneblockingandwashingForotherpartofmembrane,pouroffTBSbuffer.Add3%blockingbuffer，rockgentlyforatleast1h.Pouroff3%blockingbufferandrinsebrieflywithTBSbufferthreetimes,5minutesforpertime.⑶FirstantibodyPouroffTBSbuffer.Addfirstantibodyatappropriatedilutionin10ml0.5%blockingbuffer.Rockgentlyforatleast1h;pourofffirstantibodysolutionfrommembraneandwashtwicefor10minuteswithTTBSbuffer.⑷SecondantibodyPouroffTTBSbuffer.Addsecondantibodyatappropriatedilutionin5ml0.5%blockingbuffer.Rockgentlyfor30min,pouroffsecondantibodysolutionfrommembraneandwashtwicefor10minuteswithTTBSbuffer.⑸DetectionPouroffTTBSbufferfrommembraneandadddevelopingreagent,RockPVDFgently,monitoringdevelopment.Whenthebandscanbeseenclearly,stopdevelopmentbywashingmembranewithdistilledwaterfor30minuteswith3changes.【Result】Checkthebandsonmembrane,thebandwithblue-purplecolorcorrespondingtothetargetprotein.实验材料】1.实验器材SDS/PAGE实验相关材料；电转移装置；供电设备；PVDF膜（MilliporeImmobion-P#IPVH00010）；Whatman3MM纸；其他工具：镊子、海绵垫、剪子、手套、小塑料或玻璃容器、浅盘。Detection2.实验试剂⑴10x转移缓冲溶液（1L）：30.3gTrizmabase（0.25M）,144g甘氨酸（1.92M）,加蒸馏水至1L,此时pH约为8.3，不必调整。⑵1x转移缓冲溶液（2L）：在1.4L蒸馏水中加入400ml甲醇及200ml10x转移缓冲溶液。⑶TBS缓冲溶液:将1.22gTris（10mM）和8.78gNaCl（150mM）加入到1L蒸馏水中，用HCl调节pH至7.5。⑷TTBSbuffer：在1LTBS缓冲溶液中加入0.5mlTween20（0.05%）。⑸一抗：兔抗待测蛋白抗体（多克隆抗体）。（6）二抗：辣根过氧化物酶标记羊抗兔。⑺3%封阻缓冲溶液（0.5L）：牛血清白蛋白15mg加入TBS缓冲溶液并定容至0.5L，过滤，在4°C保存以防止细菌污染。⑻0.5%封阻缓冲溶液（0.5L）：牛血清白蛋白2.5mg加入TTBS缓冲溶液并定容至0.5L，过滤，在4°C保存以防止细菌污染。⑼显影试剂：1ml氯萘溶液（30mg/ml甲醇配置），加入10ml甲醇，加入TBS缓冲溶液至50ml，加入30ul30%H2O2。⑽染色液：1g氨基黑18B（0.1%），250ml异丙醇（25%）及100ml乙酸（10%）用蒸馏水定容至1L。⑾脱色液：将350ml异丙醇（35%）和20ml乙酸（2%）用蒸馏水定容至1L。[详细]

  2018-09-27 10:01

  产品样册

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• GE核酸蛋白印迹标记检测产品目录

  GE核酸蛋白印迹标记检测产品目录[详细]

  2014-03-27 00:00

  选购指南

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• 定量western blot ：为什么需要验证抗体

  验证抗体对于WB结果的一致性和重复性是至关重要的，即确认抗体能特异性识别感兴趣的蛋白，抗体与其他蛋白的交叉反应性情况。在您的论文提交给期刊发表之前，经常需要验证抗体的特异性，但并非所有人都花时间进行验证。或者很多人都认为他们使用抗体进行了免疫共沉淀验证，因而不需要再通过蛋白质印迹进行验证。然而，抗体与抗原的亲和性高度依赖于实验条件，因此，验证您的试验方法中的条件适用于抗体与抗原的结合是十分重要的。在《JBC》杂志中关于抗体验证信息如下:[详细]

  2024-09-30 01:34

  实验操作

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• 使用 ScanLater Western Blot protein Ladder 估算蛋白分子量

  使用 ScanLater Western Blot protein Ladder 估算蛋白分子量[详细]

  2024-09-27 05:16

  应用文章

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• 一文教你如何在Western Blot中选择一抗？

  说到免疫印迹Z重要的就是抗体的选择了。在免疫印迹中我们会用到一抗和二抗等抗体，本文着重给大家介绍一下一抗的选择。 一抗就是能和特异性抗原特异性结合的蛋白。种类包括单克隆抗体和多克隆抗体。抗体因其种属来源不同可以分为多种类型，如鼠抗，兔抗，羊抗等等，那么在使用时我们应该怎么选择呢？ 检测任何一种目的蛋白都有不止一种抗体可供选择，为了在试验过程中尽快找到Z适合的抗体，往往需要考虑以下几种因素： 1.确定自己的实验类型。如WB、IHC、ICC、ELASA等。一般的抗体说明书上都会给出该抗体适用于哪一种分析类型。 2. 单克隆or多克隆抗体的选择。一般单克隆抗体特异性强，但亲和力相对小，检测抗原灵敏度相对就低；而多克隆抗体特异性稍弱，但抗体的亲和力强，灵敏度高，但极易出现非特异性条带。 3.确定自己的实验样本的结构信息。不同的抗体是由不同的免疫原（全长蛋白、蛋白片断、多肽、全有机体或细胞等）免疫宿主而制备得来，抗体说明书一般都有免疫原的描述，如果检测的样本是蛋白片断或蛋白全长的某一区域，则必须选择用含此片段结构域的免疫原制备出的抗体。还有一点就是样本的制备过程，有些抗体要求样本经过某些特殊处理[详细]

  2019-11-18 17:12

  实验操作

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• 特惠当夏 买满就送

  特惠当夏 买满就送[详细]

  2013-05-27 00:00

  产品样册

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• 中试冻干机暑期特惠通知

  中试冻干机暑期特惠通知[详细]

  2024-09-28 03:38

  安装说明

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• 如何对化学发光Western Blot (1D 和2D) 进行高质量的成

  如何对化学发光Western Blot (1D 和2D) 进行高质量的成[详细]

  2024-09-15 22:18

  其它

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• Western Blot结果出乎意料，有可能是转印海绵垫惹的祸

  转印问题的常见根源是三明治结构的松紧度。三明治结构一定要紧！请定期更换转印海绵垫，以确保实验结果的准确性。使用额外的滤纸来填补海绵的磨损，可能会导致传输不一致。 我们都会定期更换海绵垫，因为它们会吸收污染物，随着时间的推移，转印海绵垫也会被污染。使用干净的海绵垫对荧光应用尤为关键，因为这些污染物会产生自发荧光，从而导致高背景。 [详细]

  2024-09-30 01:24

  实验操作

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• 中科惠分水质分析方案

  中科惠分水质分析方案[详细]

  2024-09-15 10:19

  选购指南

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• 中科惠分水质分析方案

  中科惠分水质分析方案[详细]

  2024-09-15 23:46

  课件

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• GE环境监测同步方案

  GE环境监测同步方案[详细]

  2014-04-16 00:00

  报价单

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• GE 凝胶过滤、亲和、新填料 秋季75折大促销

  GE 凝胶过滤、亲和、新填料 秋季75折大促销[详细]

  2012-09-29 00:00

  课件

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• 中科惠分非甲烷总烃分析方案

  中科惠分非甲烷总烃分析方案[详细]

  2024-09-18 04:33

  标准

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• 中科惠分非甲烷总烃分析方案

  中科惠分非甲烷总烃分析方案[详细]

  2024-09-28 14:06

  安装说明

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• 德国IKA 超值蒸馏解决方案限量特惠

  德国IKA 超值蒸馏解决方案限量特惠[详细]

  2015-06-10 00:00

  专利

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• posi-flate蝶阀486系列美国原装特惠

  posi-flate蝶阀486系列美国原装特惠关于美国posi-flate蝶阀目前国内没有生产工厂和办事处，主要我们是美国直接厂家选型订货，只要您这边提供材质密封材质等我司均可提供选型以及技术服务，我司在美国开设分公司，直接厂家订货，价格优势明显，货期Z快8-10周！欢迎新老客户询价采购！美国Posi-flate蝶阀设计是独特的，通常采用气体压力使阀座向着阀盘伸展，以便于随时为密封提供均匀分布的压力。由于在阀门的开启和关闭期间，阀盘和阀座只会发生瞬时接触，从而使阀盘仅受到轻微的碰撞。相反，对于一般的蝶阀来说，阀盘擦过阀座产生的碰撞，必定会降低阀门的性能和寿命。posi-flate蝶阀486系列美国原装特惠美国POSI-FLATE486系列是全不锈钢蝶阀。充气密封蝶阀不锈钢外壳材料是316L。单块盘轴在许多材料包括316L不锈钢等合金。该阀瓣可以抛光到镜面抛光或涂覆聚四氟乙烯尼龙或其他高性能涂层。不锈钢阀门适用于粉末，颗粒，泥浆和液体，在尺寸2“（50毫米）20“（500毫米）。典型的应用包括加载和卸载过程中材料，无菌空气控制，和存储容器或料斗出口阀。实际上，使用Posi-flate蝶阀时打开和关闭只需要很小的扭矩。这样可以使用较小的执行器，从而降低整个阀门的成本。Posi-flate蝶阀的特点就是低摩擦，小扭矩，耐磨损，高寿命。性能特性充气式阀座可补偿阀瓣和阀座磨损延长阀门的使用寿命posi-flate蝶阀Z小的阀座磨损没有圆盘撞击极低的转矩要求致动器成本低更多的密封接触面积posi-flate蝶阀研磨性和干性固体颗粒防止物质堆积的光盘两轴密封多个轴承posi-flate蝶阀故障安全监控温度限制:-40-350华氏度(-40-175摄氏度)，因施工的应用和材料而异。posi-flate蝶阀空气供应:115PSIG(7.9条)Zda的座位，不同于应用。posi-flate蝶阀工作压力:全真空到100个PSIG(6.9条)，随建筑材料的不同而变化。操作扭矩:随应用程序而变化。posi-flate蝶阀486系列美国原装特惠[详细]

  2018-10-26 10:00

  产品样册

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• 中科惠分反式脂肪酸分析方案

  中科惠分反式脂肪酸分析方案[详细]

  2016-02-19 00:00

  专利

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