基因组DNA文库构建必备实验技巧
本文由 上海恒远ELISA试剂盒供应商 整理汇编
2018-11-16 10:02 1812阅读次数
文档仅可预览首页内容，请下载后查看全文信息！
立即下载
基因组DNA文库构建必备实验技巧基因组DNA文库用途十分广泛,如用于人类及动植物基因组学研究,基因表达调控研究,分析、分离特定的基因片段等.通常情况下,基因组文库构建的基本流程可以归为四大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞.一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问,高质量的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的.需要通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法,在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解,同时也要尽量保证DNA的纯度.二、处理基因组DNA根据研究目的,研究者需要选择合适的载体.不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求,必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库.比如,对于黏粒载体,合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体,合适的片段长度平均为120kb-300kb.构建黏粒基因组DNA文库,需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA,可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段,随后使用胶回收试剂盒回收DNA.构建BAC基因组DNA文库,需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoRI、BamHI或者HindIII）来消化基因组DNA,然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb）,随后透析回收DNA.需要注意：（1）电泳时,要选用合适的DNALadder,以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA.（2）电泳以后,应尽量缩短用紫外光照射目标DNA的时间,否则会显著降低克隆效率.（3）回收DNA的时候,应该要避免过度离心,以防止DNA被剪切,降低文库质量.三、载体的选择目前,常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）.选用何种载体可以参考如下几个因素：1、目标区域的大小：如果基因组的目标区域很小（小于50kb）,那么可以选择黏粒载体甚至λ噬菌体载体.利用现有的商品化的黏粒载体、GX率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株,可以方便的构建黏粒载体文库.如果基因组的目标区域比较大,那么P1、PAC或者BAC就比较合适了.P1操作比较困难,PAC相对简便.BAC载体也是很好的选择,可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库,比如商业化的一系列BAC载体及配套试剂盒.如果目标区域非常大（大于250kb）,那么YAC载体就是了.不过,应用YAC载体来构建基因组文库,操作非常繁琐困难.表1各种载体的比较载体容量（kb）宿主导入细胞方式黏粒30-45大肠杆菌转导P170-100大肠杆菌转导PAC130-150大肠杆菌电转BAC120-300大肠杆菌电转YAC250-400酵母转化2、筛选文库的难易程度：黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选,但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费.大容量载体文库,如P1、PAC、BAC、YAC,以二维阵列保存,既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选,又可以用PCR进行多克隆的群体筛选.而且,使用高容量载体构建文库,可以减少染色体步查的步骤.3、载体拷贝数的考虑：当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时,克隆DNA会发生重组,从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈.对这一矛盾的解决方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系统,CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点.单拷贝载体能提高插入片段的稳定性,而且能在诱导剂的作用下,即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA.四、将基因组DNA片段连接入载体使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体.许多商业化载体已经经过预处理,可以直接使用,无需内切酶消化及脱磷酸化处理.选用连接快、效率高的连接酶,连接反应体系以100μl为宜.注意：BAC载体连接完以后,需要将连接产物做脱盐处理,除去连接反应缓冲液里的盐分.五、将重组载体转入宿主细胞如果构建黏粒文库,需要用包装蛋白来包装上述的连接反应产物,测定包装好的黏粒克隆的滴度,然后转染.挑出重组子,鉴定插入片段的大小.如果文库的大小和质量都令人满意的话,就可以铺板进行文库筛选,或者扩增、保存文库.如果构建BAC文库,应选择电转法,将上述连接产物转入受体菌,涂板长出克隆.获得克隆后需要对BAC克隆的大小进行评估,确定文库大小是否能够满足要求.如果文库大小合适,就可以进行后续操作了.六、文库克隆数的确定基因组DNA文库需要包含足够多的克隆,来保证文库的代表性.一般使用如下的经验公式来确定：N=ln（1-P）/ln（1-f）P是希望得到的覆盖率,f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值,N是所需的克隆数.举例来说,用BAC载体构建人类基因组文库,人类基因组大小为3x109bp,插入片段大小为100kb,希望覆盖率99%,那么所需要的BAC克隆数为N=ln（1-0.99）/ln（1-[106bp/3x109bp]）=138,298技术支持资料：材料缓冲液和溶液-碱裂解液I,4°C50mM葡萄糖25mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）配制碱裂解液I约100ml,灭菌,保存在四度.-碱裂解液II,新鲜配置,室温保存0.2NNaOH（从10N的NaOH新鲜制备）1%（w/v）SDS碱裂解液II应该新鲜配制,室温保存.-碱裂解液III,4°C5M醋酸钾,60ml冰醋酸,11.5mlSDW,28.5ml-酒精-70%酒精-异丙醇-酚：氯仿（1：1,v/v）-醋酸钠（3M,pH5.2）-STE,4°C10mMTris-Cl（pH8.0）0.1MNaCl1mMEDTA（pH8.0）-TE（pH8.0）10mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）载体与菌株BAC转化的大肠杆菌培养基和抗生素含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液体培养基酶和缓冲液溶菌酶RNaseA,不含DNase限制性内切酶和相应缓冲液核苷酸/寡核苷酸用于脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）的DNA标准参照物凝胶/点样缓冲液脉冲场凝胶电泳（Pulsed-fieldgels,或者0.5%琼脂糖凝胶）离心机/转头/离心管其他37摄氏度摇床1.BACDNA大量提取方案（参考文献：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案适合从500ml的菌液中提取BACDNA,一般可以产生20-25μg纯化的DNA.方法1.将50μlBAC转化菌的过夜培养物接种到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中,37℃震荡（280rpm）培养12到16小时.2.2500g,4℃,离心15min,收集菌体.3.用100ml冰预冷的STE重新悬浮细菌沉淀.按步骤2方法离心收集细菌.4.用24ml含RNase（100μg/ml）的碱性裂解液I溶解细菌.加溶菌酶至终浓度为1mg/ml.5.加入24ml新鲜配置的碱性裂解液II.盖紧离心瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,冰裕5min.6.加入24ml冰预冷的碱性裂解液III,盖紧瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,置冰上5min.7.15000g,4℃,离心10min,将上清转移到另一离心瓶中,弃沉淀.8.加等体积的酚：氯仿.轻轻翻转离心瓶数次,混匀.3000g,室温离心15min.9.将水相移至另一离心瓶中,加入等体积的异丙醇,翻转离心瓶数次,混匀.10.15,000g,室温离心15分钟,回收核酸沉淀.11.弃上清,用20ml70%乙醇漂洗沉淀.12.弃乙醇,风干使乙醇挥发殆尽.13.小心将BACDNA沉淀溶于0.2mlTE（pH8.0）中.2.BACDNA的小量提取（参考文献：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案适合从5ml菌液中提取BACDNA,一般可以产生0.1-0.4μg的BACDNA.方法：1.挑取单菌落接种至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中,37℃剧烈震摇过夜.2.2000g,4℃,离心5min,收集菌体.3.在每个离心管中加5ml预冷的STE,用移液器吹悬细菌沉淀.按步骤2离心收集细菌.4.将菌体重悬于200ul冰冷的碱性裂解液I中.将菌体转移至预冷的微量离心管中,置于冰上.5.向管中加入400μl新鲜配置的碱性裂解液II.轻轻翻转数次,将离心管置于冰上.6.向管中加入300μl冰冷的碱性裂解液III,轻轻翻转数次.将离心管置于冰上5min.7.在微量离心机上以Zda速度4℃离心5min,除去细胞碎片沉淀.将上清移入一新的微量离心管中.室温下加入900μl异丙醇,轻轻翻转数次离心管,混匀.8.立即在微量离心机上室温下Zda速离心5min,使核酸沉淀.弃去上清,用1ml70%乙醇小心漂洗.室温下离心2min,吸去乙醇.室温干燥沉淀5-10min后,将沉淀溶于50μlTE（pH8.0）中.
登录或新用户注册
请用手机微信扫描下方二维码登录 或注册新账号
微信扫码，手机电脑联动
更多资料
基因组DNA文库构建必备实验技巧 基因组DNA文库构建必备实验技巧基因组DNA文库用途十分广泛,如用于人类及动植物基因组学研究,基因表达调控研究,分析、分离特定的基因片段等.通常情况下,基因组文库构建的基本流程可以归为四大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞.一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问,高质量的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的.需要通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法,在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解,同时也要尽量保证DNA的纯度.二、处理基因组DNA根据研究目的,研究者需要选择合适的载体.不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求,必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库.比如,对于黏粒载体,合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体,合适的片段长度平均为120kb-300kb.构建黏粒基因组DNA文库,需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA,可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段,随后使用胶回收试剂盒回收DNA.构建BAC基因组DNA文库,需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoRI、BamHI或者HindIII）来消化基因组DNA,然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb）,随后透析回收DNA.需要注意：（1）电泳时,要选用合适的DNALadder,以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA.（2）电泳以后,应尽量缩短用紫外光照射目标DNA的时间,否则会显著降低克隆效率.（3）回收DNA的时候,应该要避免过度离心,以防止DNA被剪切,降低文库质量.三、载体的选择目前,常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）.选用何种载体可以参考如下几个因素：1、目标区域的大小：如果基因组的目标区域很小（小于50kb）,那么可以选择黏粒载体甚至λ噬菌体载体.利用现有的商品化的黏粒载体、GX率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株,可以方便的构建黏粒载体文库.如果基因组的目标区域比较大,那么P1、PAC或者BAC就比较合适了.P1操作比较困难,PAC相对简便.BAC载体也是很好的选择,可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库,比如商业化的一系列BAC载体及配套试剂盒.如果目标区域非常大（大于250kb）,那么YAC载体就是了.不过,应用YAC载体来构建基因组文库,操作非常繁琐困难.表1各种载体的比较载体容量（kb）宿主导入细胞方式黏粒30-45大肠杆菌转导P170-100大肠杆菌转导PAC130-150大肠杆菌电转BAC120-300大肠杆菌电转YAC250-400酵母转化2、筛选文库的难易程度：黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选,但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费.大容量载体文库,如P1、PAC、BAC、YAC,以二维阵列保存,既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选,又可以用PCR进行多克隆的群体筛选.而且,使用高容量载体构建文库,可以减少染色体步查的步骤.3、载体拷贝数的考虑：当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时,克隆DNA会发生重组,从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈.对这一矛盾的解决方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系统,CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点.单拷贝载体能提高插入片段的稳定性,而且能在诱导剂的作用下,即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA.四、将基因组DNA片段连接入载体使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体.许多商业化载体已经经过预处理,可以直接使用,无需内切酶消化及脱磷酸化处理.选用连接快、效率高的连接酶,连接反应体系以100μl为宜.注意：BAC载体连接完以后,需要将连接产物做脱盐处理,除去连接反应缓冲液里的盐分.五、将重组载体转入宿主细胞如果构建黏粒文库,需要用包装蛋白来包装上述的连接反应产物,测定包装好的黏粒克隆的滴度,然后转染.挑出重组子,鉴定插入片段的大小.如果文库的大小和质量都令人满意的话,就可以铺板进行文库筛选,或者扩增、保存文库.如果构建BAC文库,应选择电转法,将上述连接产物转入受体菌,涂板长出克隆.获得克隆后需要对BAC克隆的大小进行评估,确定文库大小是否能够满足要求.如果文库大小合适,就可以进行后续操作了.六、文库克隆数的确定基因组DNA文库需要包含足够多的克隆,来保证文库的代表性.一般使用如下的经验公式来确定：N=ln（1-P）/ln（1-f）P是希望得到的覆盖率,f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值,N是所需的克隆数.举例来说,用BAC载体构建人类基因组文库,人类基因组大小为3x109bp,插入片段大小为100kb,希望覆盖率99%,那么所需要的BAC克隆数为N=ln（1-0.99）/ln（1-[106bp/3x109bp]）=138,298技术支持资料：材料缓冲液和溶液-碱裂解液I,4°C50mM葡萄糖25mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）配制碱裂解液I约100ml,灭菌,保存在四度.-碱裂解液II,新鲜配置,室温保存0.2NNaOH（从10N的NaOH新鲜制备）1%（w/v）SDS碱裂解液II应该新鲜配制,室温保存.-碱裂解液III,4°C5M醋酸钾,60ml冰醋酸,11.5mlSDW,28.5ml-酒精-70%酒精-异丙醇-酚：氯仿（1：1,v/v）-醋酸钠（3M,pH5.2）-STE,4°C10mMTris-Cl（pH8.0）0.1MNaCl1mMEDTA（pH8.0）-TE（pH8.0）10mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）载体与菌株BAC转化的大肠杆菌培养基和抗生素含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液体培养基酶和缓冲液溶菌酶RNaseA,不含DNase限制性内切酶和相应缓冲液核苷酸/寡核苷酸用于脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）的DNA标准参照物凝胶/点样缓冲液脉冲场凝胶电泳（Pulsed-fieldgels,或者0.5%琼脂糖凝胶）离心机/转头/离心管其他37摄氏度摇床1.BACDNA大量提取方案（参考文献：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案适合从500ml的菌液中提取BACDNA,一般可以产生20-25μg纯化的DNA.方法1.将50μlBAC转化菌的过夜培养物接种到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中,37℃震荡（280rpm）培养12到16小时.2.2500g,4℃,离心15min,收集菌体.3.用100ml冰预冷的STE重新悬浮细菌沉淀.按步骤2方法离心收集细菌.4.用24ml含RNase（100μg/ml）的碱性裂解液I溶解细菌.加溶菌酶至终浓度为1mg/ml.5.加入24ml新鲜配置的碱性裂解液II.盖紧离心瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,冰裕5min.6.加入24ml冰预冷的碱性裂解液III,盖紧瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,置冰上5min.7.15000g,4℃,离心10min,将上清转移到另一离心瓶中,弃沉淀.8.加等体积的酚：氯仿.轻轻翻转离心瓶数次,混匀.3000g,室温离心15min.9.将水相移至另一离心瓶中,加入等体积的异丙醇,翻转离心瓶数次,混匀.10.15,000g,室温离心15分钟,回收核酸沉淀.11.弃上清,用20ml70%乙醇漂洗沉淀.12.弃乙醇,风干使乙醇挥发殆尽.13.小心将BACDNA沉淀溶于0.2mlTE（pH8.0）中.2.BACDNA的小量提取（参考文献：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案适合从5ml菌液中提取BACDNA,一般可以产生0.1-0.4μg的BACDNA.方法：1.挑取单菌落接种至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中,37℃剧烈震摇过夜.2.2000g,4℃,离心5min,收集菌体.3.在每个离心管中加5ml预冷的STE,用移液器吹悬细菌沉淀.按步骤2离心收集细菌.4.将菌体重悬于200ul冰冷的碱性裂解液I中.将菌体转移至预冷的微量离心管中,置于冰上.5.向管中加入400μl新鲜配置的碱性裂解液II.轻轻翻转数次,将离心管置于冰上.6.向管中加入300μl冰冷的碱性裂解液III,轻轻翻转数次.将离心管置于冰上5min.7.在微量离心机上以Zda速度4℃离心5min,除去细胞碎片沉淀.将上清移入一新的微量离心管中.室温下加入900μl异丙醇,轻轻翻转数次离心管,混匀.8.立即在微量离心机上室温下Zda速离心5min,使核酸沉淀.弃去上清,用1ml70%乙醇小心漂洗.室温下离心2min,吸去乙醇.室温干燥沉淀5-10min后,将沉淀溶于50μlTE（pH8.0）中.[详细]
2018-11-16 10:02
产品样册
Eppendorf 工作站NGS文库构建方案 高质量的下一代测序 (NGS) 文库的制备是一个复杂的过程，需要投入大量时间、经费和专业知识。珍贵样品通常要处理多日（取决于所用试剂盒），直至准备好文库进行测序。完整的方法由多个部分组成，每个都有特有的精度要求和数百个移液步骤。由于移液精度取决于用户，因此导致了不稳定性，这对重复性产生了负面影响。
Eppendorf epMotion® 自动移液工作站可以用极少的用户干预和设定时间来简化这个费力的过程，即使是对于样本数量较少的操作也可使用。为了尽可能减少编程并让您快速启动和运行，Eppendorf 提供了经过预先优化和试剂厂家认可的 NGS 试剂盒方法，这将获得可重复的优质的二代测序文库。[详细]
2023-09-15 15:01
应用文章
细菌基因组DNA纯化试剂盒 本公司新推出的全新细菌基因组纯化试剂盒，操作简便，纯化量大，可纯化革兰氏阳性和阴性菌的基因组DNA。细菌基因组DNA提取试剂盒使用说明本试剂盒可用于革兰氏阴性和阳性菌的基因组DNA提取，由细菌重悬液、裂解液、蛋白沉淀液以及DNA溶解液组成。可从1-5ml菌液中提取基因组DNA。整个提取过程不超过45分钟。提取过程包括：1菌液离心，重悬。2裂解菌体，释放基因组DNA。3盐析沉淀蛋白，分离DNA。4异丙醇沉淀脱盐并浓缩。570%乙醇清洗，晾干并用DNA溶解液溶解。本试剂盒采用复合裂解液，其中含有YZDNA酶的成分，在加热（65°C）状态下，可保证完整的细菌基因组DNA的充分裂解释放，本试剂盒即可提取异丙醇沉淀时，罕见浑浊的蛋白质杂质的共沉淀。提取的基因组可用于PCR扩增、内切酶消化以及膜杂交等。一、试剂盒组成（本试剂盒提供的组份,至少可提取100份1-5ml菌液基因组DNA的纯化，每种组份均有足够的富余量）1．复合裂解液：30ml1瓶。2．蛋白沉淀液：300ml1瓶。3．DNA溶解液：20ml1瓶。4．操作说明书一份。二、本试剂盒未提供，须用户自备的试剂为：异丙醇，70%乙醇（国产分析纯）。三、提取操作：1．菌液离心：取革兰氏阴性菌菌液1-2ml；或者革兰氏阳性菌菌液2-5ml，1000rpm离心1分钟。2．加入细菌重悬液100ul，震荡使菌体重悬。3．将复合裂解液置65°C水浴加热，使结晶成分溶解，每个细菌重悬液中分别加入300ul的复合裂解液。4．混璇器震荡混匀10秒，置65°C水浴中反应10分钟（革兰氏阴性菌），20分钟（革兰氏阳性菌）。5．各管中加入300ul蛋白沉淀液。上下颠倒5-6次使两者混匀。6．13000-16000×g,离心3-5分钟。7．将上清液转移至新的离心管中（注意：由于有些细菌含有多糖或者脂蛋白成分，离心后会出现细胞成分上浮的情况，此时取漂浮层下的均一透明液体），加入等体积异丙醇，此时可见透明的絮状物，混匀后离心，同步骤5，吸去上清。8．离心管中加入200ul，70%的乙醇溶液，来回倒置，清洗管壁，离心同上。9．移去70%乙醇，倒置离心管于干净的滤纸上，自然干燥10-15分钟，加入DNA溶解液100ul。10．快速漩涡震荡1-2秒，使DNA溶解液冲刷到所有沉淀的DNA。11．将纯化的全血基因组置65C水浴1小时，或4C过夜使DNA充分溶解（要求不严格的PCR试验可缩短时间或省去该步），轻轻弹动管壁有助于溶解基因组DNA可直接进行PCR等下一步操作。四、注意事项：1.用户可选择使用RNaseA,使用方法为：在第3步完成后1.5ulRNaseA,混匀后，37C孵育15分钟，冷却至室温。（RNaseA的配法：将RNaseA溶于TEbuffer中，浓度为4mg/ml,煮沸10分钟，以去除DNase,分装后-20C保存；也可购买配好的试剂使用。）2.革兰氏阳性菌由于细胞壁的存在，纯化的量较阴性菌要少一倍以上。3.提取得DNA样本在70%乙醇中，存于-80C，可长期保存。五、储存条件：本试剂盒在室温条件下可保存一年。[详细]
2024-09-29 11:00
产品样册
病毒基因组提取试剂盒（DNA）说明书 病毒基因组提取试剂盒（DNA）说明书[详细]
2016-05-25 00:00
操作手册
用 Retsch MM301基因组DNA快速提取 用 Retsch MM301基因组DNA快速提取[详细]
2007-03-15 00:00
实验操作
病毒基因组提取试剂盒（DNA/RNA)说明书 病毒基因组提取试剂盒（DNA/RNA)说明书[详细]
2016-05-25 00:00
产品样册
实时定量PCR实验技巧 实时定量PCR实验技巧[详细]
2016-05-03 00:00
安装说明
做实验时马弗炉使用技巧 做实验时马弗炉使用技巧[详细]
2012-08-22 00:00
报价单
做实验的十八般技巧---实验室材料 做实验的十八般技巧---实验室材料[详细]
2007-11-07 00:00
操作手册
质粒构建 质粒构建[详细]
2024-09-20 13:38
标准
酵母双杂交的实验步骤和技巧分析 LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD（202个氨基酸残基组成的LexA蛋白）与目标蛋白（钓饵，Bait）的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点（EcoRI与XhoI）上游，含有SV40核定位（SV40nuclearlocalization）、HA（血凝素）及AD（来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白）等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。二、商品化酵母双杂交系统的组成1.载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2.酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3.大肠杆菌菌株：E.coliKC8株4.对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T阳性对照pLexA-Pos（LexA/GAL4AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam（LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用）假阳性检测质粒5.引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。三、酵母双杂交实验的基本流程1.将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。2.同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。3.构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵（bait）。4.将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48（p8op-LacZ）细胞株，用SD/-His/-Ura筛选;并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。转化质粒选择培养基克隆生长情况说明（含有Gal/Raf）pLexA-PosSD/-His，-Ura蓝阳性对照pLexASD/-His，-Ura白阴性对照PlexA-XSD/-His，-Ura白没有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura蓝具有直接激活活性PlexA-XSD/-His，-Ura菌落不能生长酵母细胞毒性4-1.如果pLexA-X-半乳糖苷酶的信号作用。b能够自动激活报告基因，则设法去除其激活活性部位、或者将LacZ报告基因整合入基因组，减少4-2.如果pLexA-X虽然不会自动激活报告基因，但对酵母宿主细胞有毒性，则需要与纯化的文库DNA同时转化酵母。5.如果pLexA-X既不会自动激活报告基因，也不具有毒性，则可以与纯化的文库DNA同时、或顺序转化酵母细胞，并检测质粒转化效率。转化质粒SD固体培养基LacZ表型对照1pLexA-PosGal/Raf/-His/-Ura蓝对照2pLexA-53Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu蓝+pB42AD-T实验pLexA-XGal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu待测+pB42AD-文库5-1.用SD/-His/-Trp/-Ura培养基选择阳性共转化子，并扩增，使宿主细胞中的质粒在诱导前达到Zda拷贝数。-半乳糖苷酶无表达。b5-2.上述重组子转至含X-gal的固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Trp/-Ura/-Leu，观察LacZ及Leu报告基因的表达情形，蓝色克隆即为阳性。白色克隆为假阳性，说明Leu虽有表达，但5-3.同时用LacZ、Leu两个报告基因的目的，是为了尽可能消除实验的假阳性误差，譬如：AD融合蛋白不与目标蛋白结合，而直接与启动子序列结合域结合等情况。由于2个报告基因的启动子不同，出现上述假阳性的几率就大大减少了。5-4.将蓝色阳性克隆进行1次以上的划种，尽可能分离克隆中的多种文库质粒。6.阳性克隆的筛选6-1.随机选取50个阳性克隆，扩增、抽提酵母质粒，电转化E.coliKC8宿主菌，抽提大肠杆菌中的质粒，酶切鉴定是否具有插入片段及排除相同的文库质粒。6-2.如果重复的插入序列较多，可另取50个阳性克隆来分析。Z后得到数种片段大小不同的插入序列，再转化新的宿主细胞，检测是否仍为阳性克隆。7.用质粒自然分选法（NaturalSegregation）筛除只含有AD-文库杂合子的克隆7-1.将初步得到的阳性克隆接种SD/-Trp/-Ura液体培养基，培养1-2天，含有HIS3编码序列的BD-靶质粒在含有外源His培养基中，将以10%-20%左右的频率随机丢失。C孵育2-3天。°7-2.将上述克隆，转铺固体培养基SD/-Trp/-Ura，307-3.再挑取生长的单克隆，转入SD/-Trp/-Ura和SD/-His/-Trp/-Ura培养基中，筛选His表型缺陷的克隆，即得到只含有AD-文库杂合子的重组子。7-4.将His表型缺陷的克隆转化固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-Trp/-Ura，以验证AD-文库能否直接激活报告基因的表达，弃去阳性克隆，保留阴性克隆。8.酵母杂合试验（YeastMating）确定真阳性克隆如下表所示，在酵母EGY48及其对应的YM4271宿主细胞中分别转入相应的质粒或文库DNA，通过杂合实验确筛选pLexA-靶DNA与pB42AD-文库确实具有相互作用的真阳性克隆。质粒1（inYM4271）质粒2（inEGY48）LacZ表型Leu表型pLexApB42AD白不能生长pLexA-靶DNApB42AD白不能生长pLexApB42AD-文库白不能生长pLexA-靶DNApB42AD-文库蓝真阳性pLexA-LampB42AD-文库白不能生长9.阳性克隆的进一步筛选和确证9-1.扩增初步确定的阳性克隆，抽提酵母DNA。该DNA为混合成份，既含有酵母基因组DNA，也含有3种转化的质粒DNA。9-2.将上述DNA电转化E.coliKC8宿主菌。由于在大肠杆菌中，具有不同复制起始调控序列的质粒不相容;同时利用营养缺陷型筛选。因此，在M9/SD/-Trp培养基上，只有含有AD-文库质粒的转化菌才能生长，将其扩增、并抽提质粒DNA，酶切鉴定。9-3.用pLexA-靶DNA与pB42AD-库DNA一一对应、共转化只含有报告基因的酵母菌EGY48中，先到SD/-His/-Trp/-Ura板扩增，并与后面的诱导板形成对照，说明报告基因的表达与诱导AD融合蛋白的表达有关，再确证LacZ、Leu报告基因的表达。9-4.扩增与靶DNA相互作用的文库DNA，进行序列分析及进一步的结构、功能研究。10.对双杂交系统阳性结果的进一步研究10-1.用不同的双杂交系统验证10-1-1.将载体pLexA与pB42AD互换后进行双杂交实验。10-1-2.选择不同的双杂交系统，如：以GAL4转录激活子为基础的双杂交系统。10-1-3.将文库质粒移码突变后，再与靶质粒作用，报告基因是否仍能被激活。-半乳糖苷酶水平，比较作用强度变化。b10-1-4.去除或突变特定结合位点，定量检测10-2.用试剂盒提供的引物测定插入片段的DNA序列，证明其编码区域。10-3.用其它的检测方法，如：亲和色谱法或免疫共沉淀法来证明双杂交系统筛选的蛋白之间的具有相互作用。10-4.进一步研究靶蛋白与筛选蛋白之间的功能关系构建于AD载体的cDNA文库的扩增1.自-80℃冰箱取出含有cDNA文库的甘油菌，置于冰浴中缓慢化冻。2.用新鲜的LB培养液在1.5ml离心管中将上述甘油菌1:106和1:108稀释。lml加入90m3.取稀释菌液各1090mm）;37℃倒置培养过夜或30℃培养24-36hr，计数平板上单克隆菌落数。fLB培养液在1.5ml离心管中振荡混匀，涂布LB/Amp平板（4.确定待扩增的cDNA文库滴度（cfu/ml）=克隆数×108（1:106稀释）或克隆数×1010（1:108稀释）。5.按照>150mm），共100块;37℃倒置培养过夜。f2-4×104cfu/平板的浓度，涂布LB/Amp平板（6.在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上加适量LB培养液，将菌落刮下，转入2000mlLB/Amp培养液中，37℃振荡培养2-4hr。7.留取适量培养菌液以50%无菌甘油稀释至25%终浓度，分装，保存于-80℃。8.其余培养菌液离心8000xg×10min，4℃收集细菌;用质粒DNA纯化试剂盒大量抽提质粒DNA。LB液体培养基，121℃，15lb/in2灭菌15minA.bacto-Tryptone10.0gB.bacto-YeastExtract5.0gC.NaCl10.0gD.ddH2O→1000ml*LB固体培养平板为含有1.5%琼脂（Agar）LB培养基。**LB/Amp培养基为含有Ampg/ml的LB培养基。m50-100构建于AD载体的cDNA文库的纯化1.质粒DNA提取缓冲液名称缓冲液配方g/mlRNasemP1悬浮缓冲液50mMTris-HCl（pH8.0）;10mMEDTA;100AP2裂解缓冲液200mMNaOH;1%SDSP3中和缓冲液3.0MKac（pH5.5）QBT平衡缓冲液750mMNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%异丙醇;0.15%TritonX-100QC洗涤缓冲液1.0MNaCl;50mMMOPS（pH7.0）;15%异丙醇QF洗脱缓冲液1.25MNaCl;50mMTris-HCl（pH8.5）;15%异丙醇2.培养菌液离心6000xg×10min，4℃，每500ml培养物（下同）的沉淀重悬于50mlP1缓冲液。3.加入50mlP2缓冲液，倒置4-6次混匀，室温孵育5min。4.加入4℃预冷的50mlP3缓冲液，快速倒置4-6次混匀，冰浴30min（其间再倒置混匀4-6次）。5.将上述混合液再倒置混匀，离心12000xg×30min，4℃，保留上清。6.上清再离心12000xg×15min，4℃，留上清。7.将上清液上样于经35mlQBT缓冲液平衡的QIAGEN-tip层析柱。8.以100mlQC缓冲液洗涤层析柱2次。9.以35mlQF缓冲液洗脱吸附于层析柱上的DNA。10.以0.7倍体积异丙醇沉淀DNA，离心12500xg×30min，4℃，小心去除上清。11.以7ml70%乙醇洗涤沉淀DNA，离心12500xg×10min，4℃，小心去除上清。12.将沉淀的质粒DNA溶于5mlTE（pH8.0）缓冲液，转移至新的无菌离心管中，用2.5倍体积无水乙醇;1/10体积3.0MNaAc（pH5.2），于-20℃静置过夜。13.离心12500xg×20min，4℃，去除上清，沉淀用70%乙醇洗涤，超净台风干。l），保存于-20℃。mg/管（用于1次转化反应，约40m14.干燥的DNA溶于适量体积TE，定量，分装100-200构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞1.将酵母菌EGY48（p8op-lacZ）接种于5.0mlSD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0mlSD/-Ura液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.将上述新鲜培养菌液接种于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（约50ml），30℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5（约3hr）。YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml3.室温离心5000xg×5min，弃上清;加入15-25mlddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。4.准备下列试剂2×转化反应10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/120ml15mA.1×TE/LiAc0.15ml15l/ml960ml120mB.PEG/LiAc1.20ml120lml//900mC.1×TE1.00ml1005.分装待转化的质粒DNA，振荡混匀。lmg）3-5mA.pLexA-X（0.1B.10mg/mllmSpermDNA*（0.1mg）10*新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。m6.每管加入100lm7.各加入600PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。lm8.各加入70DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。9.室温离心13000xg×10sec，尽量弃上清;以0.3ml1×TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His固体培养板，30℃倒置培养3-5天。SD/-Ura，-His固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板A.DifcoNitrogen1.34gB.葡萄糖4.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）20.0mlD.20×Leu10.0mlE.20×Trp10.0mlF.Agar4.00gG.ddH2O90-100mm）f→200.0ml铺8-10块平板（附表1.不同规模转化酵母感受态细胞SmallScale*LargeScaleLibraryScale转化反应2011（1）SD液体培养基扩增酵母菌100ml100ml300ml（2）YPD液体培养基扩增酵母菌300mla300mla1000mla（3）TE或ddH2O洗涤酵母细胞15mlc25-50mlb500mla（4）准备A.1×TE/LiAc缓冲液1.5mld1.0mld8.0mlcB.PEG/LiAc缓冲液12.0mlc6.0mlc100.0mlbC.1×TE缓冲液6.0mlc10.0mlc10.0mlc（5）分装A.DNA-BDvectorgd×20/0.2-1.0mgcm0.1gd0.1-0.5mgmg×2010-50mB.ADvector0.1C.l2.0mlml×20200mSpermDNA（10mg/ml）101×TE/LiAc重悬感受态细胞1.5mlc1.0mlc8.0mlbl×201.0ml8.0mlm酵母感受态细胞100（7）PEG/LiAc缓冲液0.6ml×206.0ml60.0mll7.0mlml×20700mDMSO70（9）室温离心后弃上清13000xg×10sec2000xg×5min2000xg×5min（10）1×TE重悬感受态细胞0.3ml×206.0ml10.0ml150mm×50f150mm×30f90mm×20f铺固体选择培养基平板注:*即为“构建于DNA-BD载体的目的DNA转化酵母感受态细胞”**在不同容积的无菌离心管中进行，a:300或500ml;b:50ml;c:15ml;d:1.5ml文库cDNA转化含有DNA-BD载体的酵母感受态细胞1.以生长于SD/-Ura，-His固体培养板上的含有构建于DNA-BD载体的目的DNA及报告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作为宿主菌，制备酵母感受态细胞。2.将酵母宿主菌接种于5.0mlSD/-Ura，-His液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0mlSD/-Ura，-His液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura，-His液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×Leu5.0mlE.20×Trp5.0mlF.ddH2O→100.0ml3.将上述新鲜培养菌液接种于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（约50ml），30℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5（约3hr）。YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室温离心5000xg×5min，弃上清;加入15-25mlddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。5.准备下列试剂1×转化反应10×TE10×LiAc50%PEGddH2Olml/800ml100mA.1×TE/LiAc1.0ml100l4.8ml/ml600mB.PEG/LiAc6.0ml600C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.取1.0ml用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，加入下列成份，振荡混匀。lmg）40mA.pB42AD-Library（50-100B.10mg/mllmHerringDNA*（2.0mg）200*新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。7.加入6.0mlPEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。lm8.加入700DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。9.室温离心2000xg×5min，尽量弃上清。10.以6.0ml100mm，每稀释度各×2），30℃倒置培养3-5天，确定转化效率在2×106cfu以上有效。fl稀释不同倍数，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板（m1×TE重悬沉淀细胞，取10150mm×30），30℃倒置培养3-5天。fl涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板（m11.按每板200SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板A.DifcoNitrogen13.40gB.葡萄糖40.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）200.0mlD.20×Leu100.0mlE.Agar40.00gF.ddH2O150mm）f→2000.0ml铺30块平板（12.在超净工作台上，在所有生长菌落的平板上各加5mlTE（pH7.0）缓冲液，将菌落刮下。13.离心弃上清，加入10-20mlTE缓冲液重悬沉淀菌，加入等体积的无菌65%甘油-MgSO4缓冲液，混匀，分装1.0ml/管，保存于4℃1周或-80℃1年以上。65%甘油-MgSO4缓冲液:65%甘油;100mMMgSO4;25mMTris-HCl（pH8.0）A.甘油65.00mlB.MgSO47H2O2.465gC.2.0MTris-HCl（pH8.0）1.25mlD.ddH2O→100.00ml酵母双杂合系统阳性克隆的筛选1.经过选择培养基筛选的含有DNA-BD载体、文库DNA及报告基因的酵母感受态细胞，用无菌TE稀释至1:104、1:106和1:108等不同浓度。90mm），30℃倒置培养3-5天，计数平板上单克隆菌落数。fl，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板（m2.取上述稀释菌液各1003.确定待进一步鉴定的酵母菌滴度（cfu/ml）=克隆数×105（1:104稀释）、克隆数×107（1:106稀释）或克隆数×109（1:108稀释）。4.按照以前实验确定的文库转化效率的5-10倍的总量、0.5-2×106cfu/平板的菌量，涂布SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养板，30℃倒置培养3-5天。5.挑取显蓝色的菌落，再接种于SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基以及SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基，以进一步确证。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml灭菌（115℃，10lb/in2）15min，冷却至50℃，加入下列成份后铺板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f铺5-6块平板（10×BU缓冲液，121℃，15lb/in2灭菌15minA.Na2HPO412H2O9.30gB.NaH2PO42H2O3.90gC.ddH2O→100.0ml20mg/mlX-GalA.X-Gal40mgB.DMF2ml酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定-酵母质粒DNA的提取1.挑取经过酵母选择/诱导培养基初步鉴定的酵母单菌落，接种于5.0-10.0mlSD/-Trp液体培养基，30℃恒温，250rpm振荡培养20hr。SD/-Trp液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Ura5.0mlG.ddH2O→100.0ml2.室温离心5000xg×1min，弃上清，收菌。l酵母裂解液，振荡重悬沉淀酵母菌。m3.加入200酵母裂解液:2%TritonX-100;1%SDS;100mMNaCl;10mMTris-HCl（pH8.0）;1mMEDTAA.10%TritonX-10020.0mlB.10%SDS10.0mlC.NaCl0.58gD.Tris0.12gE.EDTANa22H2O0.04gF.1.0MHCl调pH8.0G.ddH2O→100.0ml4.加入下列试剂，充分振荡5min;液氮冻存10min，室温复融;再充分振荡5min。A.经酸处理的玻璃珠（Sigma）0.20gB.苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1）0.2ml5.室温离心12000xg×10min，将上清转移至新的1.5ml离心管中，加入下列试剂，于-70℃冻存30-60min。A.3MNaAc（1/10lmV）20lmB.无水乙醇（2.5V）5006.离心12500xg×10min，4℃，弃上清;70%乙醇洗涤沉淀，于37℃烘箱或超净台干燥DNA;将干燥的沉淀DNA重溶于l无菌ddH2O中，保存于-20℃。m20-30酵母双杂合系统阳性克隆的鉴定-酵母质粒DNA电转化大肠杆菌1.在冰浴条件下，取待转化DNAl感受态细胞中，混匀。mg），加入100ml（5pg-0.5m1.0WF，200m2.将上述混合液加入间距0.1cm的样品杯中，电转化（1.8kV，25。3.迅速加入1ml新鲜的LB培养液，混匀，转入1.5ml离心管中，37℃恒温，150rpm振荡孵育30-60min。4.将上述转化反应液涂布M9/DO（-Trp）固体培养板，37℃倒置培养至单菌落出现（16-22hr）。5.按常规方法扩增上述阳性转化菌，碱裂解法少量抽提质粒DNA，酶切筛选AD载体上含有插入片段的阳性克隆，保存其于25%甘油，待进一步验证。M9/DO-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15minA.葡萄糖1.2gB.Agar6.0gC.5×M9缓冲液60mlD.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）30mlE.20×His15mlF.20×Leu15mlG.20×Ura15mlH.ddH2O165ml冷却至50℃左右，加入下列成份，混匀铺板I.1.0MThiamine-HCl（Vit.B1）0.3mlJ.100mg/mlAmp0.3ml90-100mm）f铺10-15块平板（大肠杆菌感受态细胞的制备（电转化）1.挑取LB固体培养基上生长的E.coliKC8单菌落，接种于5mlLB液体培养基中，37℃恒温，250rpm振荡培养过夜（约12-14hr）。2.将2.5ml新鲜菌液接种于500mlSOB培养液中，37℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.5-0.6（约2.5-3hr）。SOB液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15minA.bacto-Tryptone10.00gB.bacto-YeastExtract2.50gC.NaCl0.25gD.KCl0.09gE.MgCl26H2O1.02gF.ddH2O→500.0ml3.将培养菌液收集于离心管中，冰水浴15-20min。4.离心6000xg×10min，4℃，弃尽上清;以5ml预冷的无菌ddH2O重悬沉淀菌;再加入500ml预冷的无菌ddH2O洗涤细菌。5.重复上述步骤1次，以充分去除培养基中残余的盐离子成份。6.用40-50ml预冷的无菌10%甘油重悬沉淀细菌，转移至50ml无菌离心管中;离心6000xg×10min，4℃，弃尽上清;重复此步骤1次。7.以等体积（约1.5-2.0ml）预冷的无菌10%甘油重悬上述沉淀的感受态细胞，分装0.5ml/管（5-6次转化反应），保存于-80℃备用。酵母双杂合系统阳性克隆的确证1.以含有报告基因（p8op-lacZ）的酵母菌EGY48作为转化宿主菌。2.将酵母宿主菌接种于5.0mlSD/-Ura液体培养基中，缓振打散菌落，然后转入95.0mlSD/-Ura液体培养基中，30℃恒温，250rpm振荡培养16-18hr，至OD600>1.0。SD/-Ura液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15minA.DifcoNitrogen0.67gB.葡萄糖2.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlD.20×His5.0mlE.20×Leu5.0mlF.20×Trp5.0mlG.ddH2O→100.0ml3.将上述新鲜培养菌液接种于300mlYPD，至OD600=0.2-0.3（约50ml），30℃恒温，250rpm振荡培养至OD600=0.4-0.5（约3hr）。YPD液体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15minA.Polypepton6.0gB.bacto-YeastExtract3.0gC.葡萄糖6.0gD.ddH2O→300ml4.室温离心5000xg×5min，弃上清;加入15-25mlddH2O重悬洗涤沉淀酵母细胞，离心弃上清，沉淀用1×TE/LiAc重悬后，即为酵母感受态细胞。5.准备下列试剂20×转化反应10×TE10×LiAc50%PEGddH2Ol/1.2mlml150mA.1×TE/LiAc1.5ml150B.PEG/LiAc12.0ml1.2ml1.2ml9.6ml/C.1×TE10.0ml1.0ml//9.0ml6.分装待转化的质粒DNA。A.pLexAlmg）3-5morpLexA-X（0.1lmg）3-5mB.pB42AD-Y（0.1C.10mg/mlSpermlmDNA*（0.1mg）10*新配制时水浴煮沸20min后，插入冰浴，保存于-20℃。l用1×TE/LiAc重悬的酵母感受态细胞，振荡混匀。m7.每管加入100lm8.各加入600PEG/LiAc，振荡混匀，30℃恒温，250rpm振荡培养30min。lm9.各加入70DMSO缓和倒置混匀。42℃热休克15min，迅速插入冰浴。10.室温离心13000xg×10sec，尽量弃上清;以0.3ml1×TE重悬沉淀细胞，涂布SD/-Ura，-His，-Trp固体培养板，30℃倒置培养3-5天。SD/-Ura，-His，-Trp固体培养基，115℃，10lb/in2灭菌15min稍冷却后铺板A.DifcoNitrogen3.35gB.葡萄糖10.00gC.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）50.0mlD.20×Leu25.0mlE.Agar10.00gF.ddH2O→500.0ml90-100mm）f铺20-25块平板（11.挑取上述固体培养基上生长的含有目的DNA（X）的pLexA-X（+）或空载pLexA（-）单菌落，分别接种SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养板，30℃倒置培养3-5天。SD/Gal/Raf/-Ura，-His，-Trp，-Leu固体诱导培养基A.SD/Gal/Raf3.79gB.10×DO（-His，-Leu，-Trp，-Ura）10.0mlC.Agar2.00gD.ddH2O→85.0ml灭菌（115℃，10lb/in2）15min，冷却至50℃，加入下列成份后铺板E.10×BU10.0mlF.20mg/mlX-gal0.4ml90-100mm）f铺5-6块平板（12.选择含有pLexA-X显蓝色，而相应的不含有插入DNA的空载pLexA显白色的克隆，扩增其在E.coliKC8中的甘油菌，按常规抽提质粒DNA，进行序列分析。10×DO（-His，-Trp，-Leu，-Ura）为不含His，Trp，Leu，Ura等成份的10×Dropout溶液。每1000ml溶液中含有下列成份，用ddH2O配制后保存于4℃。（1）L-IsoleucineL-异亮氨酸300mg（2）L-ValineL-缬氨酸1500mg（3）Adenine腺嘌呤200mg（4）L-ArginineHClL-精氨酸200mg（5）L-LysineHClL-赖氨酸盐酸盐300mgL-MethionineL-甲硫氨酸200mg（7）L-PhenylalanineL-苯丙氨酸500mgL-ThreonineL-苏氨酸2000mg（9）L-TyrosineL-酪氨酸300mg20×氨基酸储存液每100ml溶液中分别含有下列成份，配制后保存于4℃。20×HisL-HistidineL-组氨酸40mg20×TrpL-TryptophanL-色氨酸40mg20×LeuL-LeucineL-白氨酸200mg20×UraUracil尿嘧啶40mg酵母转化缓冲液:缓冲液体积缓冲液配制10×TE100mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O80ml;盐酸调pH7.5;ddH2O定容10×LiAc100mlLiAc2H2O10.20g;ddH2O50ml，冰醋酸调pH7.5;ddH2O定容50%PEG100mlPEG335050.0g;ddH2O定容其它缓冲液:缓冲液体积缓冲液配制TE1000mlTris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;盐酸调pH;ddH2O定容STE1000mlNaCl5.84g;Tris1.21g;EDTANa22H2O0.37g;ddH2O800ml;盐酸调pH8.0;ddH2O定容[详细]
2018-10-12 10:00
产品样册
猪饥饿激素（GHRL）ELISA试剂盒实验技巧 猪饥饿激素（GHRL）ELISA试剂盒实验技巧[详细]
2024-09-30 09:11
实验操作
DNA重组实验中常用的技术:质粒DNA的提取及鉴定 DNA重组实验中常用的技术:质粒DNA的提取及鉴定[详细]
2016-07-06 00:00
其它
真核细胞基因组提取 真核细胞基因组提取[详细]
2016-05-04 00:00
报价单
基因组DNA提取相关 基因组DNA相关基因组DNA提取试剂盒简介：DNA是遗传信息的载体，是Z重要的生物信息分子，是分子生物学研究的主要对象，为了进行测序、杂交、基因表达、文库构建等试验，获得高分子量和高纯度的基因组DNA是非常重要的前提，因此基因组DNA的提取也是分子生物学试验技术中Z重要、Z基本的操作之一。Solarbio公司提供各种不同样品基因组DNA提取试剂盒，如植物、动物、细菌、细胞、血液、酵母等基因组DNA提取试剂盒。所提取的基因组纯度高，片段大小在50kb左右。用户可根据需要选用不同的试剂盒来进行不同样品的抽提。基因组DNA提取的原则：1、保证核酸一级结构的完整性（因为遗传信息全部储存在核酸一级结构中，故完整的一级结构是保证核酸结构与功能研究的基础）。2、排除其它分子（如蛋白质、多糖、脂类、有机溶剂等）的污染，使下游试验顺利进行。基因组DNA提取的原理和方法：DNA与组蛋白构成核小体，核小体缠绕成中空的螺旋管状结构，即染色丝，染色丝再与许多非组蛋白形成染色体。染色体存在于细胞核中，外有核膜及胞膜。从组织中提取DNA必须先将组织分散成单个细胞，然后破碎胞膜及核膜，使染色体释放出来，同时去除与DNA结合的组蛋白及非组蛋白。1、样品预处理从各种不同来源的样品（如细菌、酵母、血液、动植物组织细胞等）中提取高纯度的基因组DNA，因细胞结构及其成分不同，样品预处理方式也不同，以下简单介绍常用提取材料的预处理方式，若需详细了解，请参考本公司各基因组DNA提取试剂盒说明书。部分样品预处理方式:植物材料液氮研磨动物材料匀浆、液氮研磨培养细胞蛋白酶K处理细菌溶菌酶破壁酵母破壁酶破壁、玻璃珠研磨血液红细胞裂解液去红细胞2、细胞裂解CTAB法：适用于植物组织、真菌等。CTAB是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物。该复合物在高盐溶液中（>0.7MNaCl）是可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、多酚等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。SDS法：适用于细菌、血液、酵母、动物组织、细胞等。SDS是一种阴离子去污剂，可溶解细胞膜，裂解细胞，使蛋白质变性、染色体解体。其它裂解方法：物理方式：机械剪切、超声波破碎、研磨匀浆等化学方式：异硫氰酸胍、碱裂解等酶法：蛋白酶K3、DNA分离纯化纯化要求：核酸样品中不应存在对酶（如核酸内切酶、DNA聚合酶等）有YZ作用的成分。其它生物大分子如蛋白质、多糖、多酚和脂类分子等污染应降低到Zdi程度。排除其它核酸分子的污染，如提DNA时应去除RNA，反之亦然。纯化方法：细胞破碎后，常使用吸附材料结合方法去除杂质和纯化DNA，主要有硅基质材料、阴离子交换树脂和磁珠等。因硅基质材料可特异吸附核酸DNA，使用方便、快捷，不需要使用有毒溶剂如酚、氯仿等，使得提取基因组像过滤一样简单，因此硅基质材料成为大规模分离纯化DNA的通用方法。硅基质材料吸附核酸的原理：主要利用DNA在高盐低pH值环境下与硅基质材料相结合，在低盐高pH值环境下与硅基质材料脱离的特征。其机理可能是高浓度盐离子破坏了硅基质水分子结构，形成阳离子桥，当盐被清除后，再水化的硅石破坏了基质和DNA之间的吸引力，因而DNA从硅基质上被洗脱下来。注意事项：尽量简化操作步骤，缩短提取过程，以减少各种有害因素对核酸的破坏。减少化学物质对DNA的降解，为避免过酸、过碱对DNA双链中磷酸二酯键的破坏，操作多在pH值4.0-10.0的条件下进行。防止基因组DNA的生物降解，主要是DNase降解基因组DNA，DNase需二价金属阳离子如Mg2+等的激活，可用EDTA等金属离子螯合剂螯合Mg2+以YZDNase的活性。减少物理因素对DNA的降解，物理降解因素主要包括机械剪切力（如剧烈振荡、搅拌等），细胞突然置于低渗液中导致的细胞爆炸式破裂，DNase大量释放，样品反复冻融和高温等。4、DNA洗脱收集DNA的洗脱效率取决于以下重要因素：洗脱液成分：采用硅基质膜吸附的DNA，可将DNA在低盐高pH值条件下洗脱下来。pH值在7.0-8.5之间洗脱效率较高，pH值低于7.0则洗脱效率很低。一般基因组提取试剂盒中的洗脱缓冲液就是TE（pH8.0），既为DNA从硅基质膜上洗脱下来提供良好的pH环境，其中的EDTA又能保证DNA不被DNase降解，同时由于EDTA浓度非常低，对核酸内切酶、DNA聚合酶的影响非常微弱，不影响后续实验，可放心使用。洗脱液体积：当洗脱液体积小于30ul时，洗脱效率很低且不稳定；当洗脱液体积在50-200ul时，洗脱效率稳定在80-90，并可保证得到Zda产量，因此洗脱液体积不能小于30ul。加洗脱液部位：100-200ul洗脱液能完全覆盖硅基质膜，DNA的洗脱量可得到保证，但当洗脱液体积较少如30-50ul时，须在硅基质膜中间部分悬空滴加洗脱液，以确保少量的洗脱液能完全覆盖硅胶膜。洗脱液的温度：在加洗脱液之前，先将洗脱液在60-75℃水浴中预热10分钟，可有效提高DNA的洗脱效率。洗脱时间和次数：加入预热的洗脱液后，可在室温放置2-5分钟使DNA完全溶解在洗脱液里通过离心而洗脱下来。同时可进行二次或三次洗脱，即将前次洗脱下来的洗脱液再上柱、离心，使前次没有洗脱下来的DNA再次溶解在洗脱液里，从而提高DNA的产量。5、DNA的定量及检测提取得到的DNA*片段需从分子质量、浓度、纯度等方面进行检测，从而判断DNA质量。用琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子质量：得到的基因组DNA*片段的大小与样品保存时间、操作过程中的剪切力等因素有关。Solarbio公司的基因组DNA提取试剂盒提取的不同材料基因组DNA*片段大小一般在50kb左右，能很好地满足后续试验的要求。通常用琼脂糖凝胶电泳分析DNA分子质量时，以溴酚蓝为示踪染料，EB染色，紫外观察，并与DNA分子量标准对照即可判断所提DNA的平均分子量。高质量的基因组DNA应显示为单一条带，如DNA降解则表现为弥散条带。用紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度：浓度测定：DNA在OD260处有显著吸收峰，OD260值为1相当于大约50ug/ml双链DNA。以下简单介绍OD260的测定方法：所提基因组DNA样品=100ul进行OD260值测定的待测样品=20ul所提基因组DNA样品+180ulTE=200ulDNA稀释倍数=200ul/20ul=10倍如200ul待测样品OD260值=0.2待测样品浓度（即100ul基因组DNA样品浓度）=50ug/ml×OD260值×稀释倍数=100ug/ml所提100ul基因组DNA样品总量=100ug/ml×100ul=10ugDNA纯度测定：一般用OD260/OD280值检测DNA样品的纯度。正常OD260/OD280值约为1.7-1.9，说明DNA纯度较好；若OD260/OD280值小于1.7，说明可能有蛋白污染；若OD260/OD280值大于2.0，说明可能有RNA污染或DNA已经降解。注：因为pH值和离子会影响光吸收值，因此洗脱时如不使用洗脱缓冲液，而使用去离子水，OD260/OD280值会偏低，但并不表示纯度低。6、DNA的储存储存溶液：DNA为两性解离分子，在碱性条件下较稳定，因此一般用TE（pH8.0）保存。TE的成分为：10mMTris-HCl（Tris与盐酸形成强的缓冲对）；1mMEDTA（乙二胺四乙酸，能螯合二价金属阳离子，YZDNase的活性）；pH8.0（碱性条件可减少DNA的脱氨作用，防止降解）。ddH2O的正常pH值为7.0，可作为DNA的储存液，但有些实验室制备的ddH2O呈酸性（pH值小于7.0），这不仅影响DNA的洗脱效率，而且导致长时间保存的DNA容易发生降解。因此建议用TE作为DNA的长期储存液。储存条件：为避免DNA降解，提取的DNA应先进行分装，然后置于-20℃或-70℃保存，同时注意避免反复冻融造成DNA降解。[详细]
2024-09-29 11:52
产品样册
高通量组织研磨仪GT100实验案例（快速提取DNA或RNA） 高通量组织研磨仪GT100实验案例（快速提取DNA或RNA）[详细]
2024-09-16 00:03
应用文章
试验室必备仪器 试验室必备仪器[详细]
2012-06-27 00:00
应用文章
实验室必备常识 实验室必备常识[详细]
2014-03-24 00:00
专利
解码姥鲨基因组 解码姥鲨基因组[详细]
2014-02-12 00:00
标准
血液基因组DNA提取试剂盒 资料名称：血液基因组DNA提取试剂盒
适用产品：使用本试剂盒回收的D N A 可适用于各种常规操作， 包括酶切、P C R 、文库构建、Southern杂交等实验。
正文语言：中文
文件编号：BP024-1
文件版本：1.0
文件格式：PDF
文件大小：0.9MB
内容简介：本试剂盒采用酶裂解法裂解血液样本，适用于从新鲜、加抗凝血剂或冷冻的血液样本中提取基因组DNA。离心吸附柱采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，可特异性、GX、专一吸附DNA，可Zda限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。[详细]
2018-05-23 09:43
其它
基因组DNA文库构建必备实验技巧
Eppendorf 工作站NGS文库构建方案
实时定量PCR实验技巧
在线留言
沪公网安备 31011502008050号
参与评论
登录后参与评论