miRNA定量及均一化cDNA文库技术

本文由 研域（上海）化学试剂有限公司 整理汇编

2024-09-29 02:39 1340阅读次数

收藏 评价 举报

• 分享

立即下载

参与评论

评论

登录后参与评论

登录或新用户注册

• 微信登录
• 密码登录
• 短信登录

请用手机微信扫描下方二维码
快速登录或注册新账号

微信扫码，手机电脑联动

注册登录即表示同意《仪器网服务条款》和《隐私协议》

账  号：

密  码：

图片码： 看不清？
换一张？

手机和邮箱号注册新账号>> 忘记密码？

手机号：

图片码： 看不清？
换一张？

短信码： 获取短信码

手机和邮箱号注册新账号>> 忘记密码？

更多资料

• miRNA定量及均一化cDNA文库技术

  进行一次逆转录即可实现所有目标miRNA的测定？没错，采用加尾法，一次逆转录就可以得到全部miRNA对应的cDNA。我们知道，真核生物mRNA都是有poly-A尾巴的，这样Oligo-dT（逆转录引物）就很容易结合到mRNA上来合成cDNA了。miRNA就缺了poly-A尾巴，怎么办呢？在逆转录试剂盒中加入poly-A聚合酶，先给它们加上一串poly-A尾巴，然后用带有一段通用序列的Oligo-dT和逆转录酶来合成cDNA。这样一来，一次逆转录反应就合成了所有miRNA以及其他snRNA、mRNA对应的cDNA，接下来想用来检测什么都可以！您只需要提供1μg合格的totalRNA，就可以对所有感兴趣的miRNA进行检测。这既可避免茎环法（各目标miRNA单独逆转录）带来的逆转录效率、加样误差等方面的影响，还可节约多条特异逆转录引物和多次逆转录反应的花费，可谓一举两得，何乐而不为？均一化cDNA文库基因转录水平上的巨大差异常常给文库筛选和分析带来障碍，采用均一化文库技术可有效克服这一问题。　均一化cDNA文库具有以下4方面的优点：**，在经济上具有广泛的应用空间，可以节约大量试验成本。第二，增加克隆低丰度mRNA的机会，适用于分析各种发育阶段或各种组织的基因表达及突变检测。第三，与原始丰度的mRNA拷贝数相对应的cDNA探针与均一化的cDNA文库作杂交，可以估计出大多数基因的表达水平及发现一些组织特异的基因。而以往的文库构建，忽略了mRNA丰度的影响。第四，可以用于遗传图谱的制作和进行大规模的原位杂交，作为优化的文库系统还可以用于大规模的测序。现在，在构建均一化的cDNA文库中至少有2种主要的观点：一种是基于复性动力学的原理，高丰度的cDNA在退火条件下复性的速度快，而低丰度的cDNA复性要很长时间，从而可以通过控制复性时间来降低丰度；另一种是基于基因组DNA在拷贝数上具有相对均一化的性质，通过cDNA与基因组DNA饱和杂交而降低在文库中高拷贝存在的cDNA的丰度。**种方法的掌握对技术的要求比较高，对多数人而言需要多次摸索才能找到Z适条件；而后一种方法易于掌握，但有研究者根据复性动力学的原理也提出了其不利因素，即采用基因组DNA饱和杂交的方法会因为低拷贝的表达基因拷贝数少而无法被杂交上。DSN（duplexspecificenzyme）是Z近发现的一种热稳定核酸酶（Shagin.,2002）。该酶能够选择性降解双链DNA和DNARNA杂交体中的DNA，对单链核酸分子几乎没有作用。同目前常用的均一化技术相比，基于DSN的均一化技术操作步骤简单，所需要的起始材料也比较少，具有较好的应用前景。上海欧易生物医学科技有限公司开展miRNA定量检测服务已经近三年时间，服务项目几百个。拥有自己的miRNA引物库（人类），对其他物种可以自行设计引物，检测样品范围广，包括：细胞、组织、血液、血浆、血清、细胞培养上清等，操作规范，时间可控，为广大研究工作者提供了良好的便利。同时，其作为国内cDNA文库构建的主流服务供应商，在长期稳定的实验服务过程中积累了丰富的经验，已经成功构建包括动物、植物、细菌等几十个物种的cDNA文库。他们基于双链特异性核酸酶（Duplex-SpecificNuclease,DSN）的先进cDNA文库均一化技术，能减低高丰度表达基因100倍以上，有效富集低丰度表达基因，从而降低冗余率。[详细]

  2024-09-29 02:39

  产品样册

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• miRNA研究新思路

  miRNA研究新思路[详细]

  2018-09-04 10:00

  产品样册

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 胎盘组织cDNA实验

  本产品是以人胎盘组织RNA为模板，oligodt以及Random为引物,用上海研谨生物的高灵敏度的逆转录酶(YJ0740)反转录得到的PCR即用型cDNA，可用于PCR实验的阳性对照。[详细]

  2024-10-02 18:23

  产品样册

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 人胎盘cDNA操作步骤

  本产品是以人胎盘组织RNA为模板，oligodt以及Random为引物,用上海研谨生物的高灵敏度的逆转录酶(YJ0740)反转录得到的PCR即用型cDNA，可用于PCR实验的阳性对照。[详细]

  2018-09-04 10:00

  产品样册

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 应用原子吸收光谱分析技术之原子化技术

  应用原子吸收光谱分析技术之原子化技术[详细]

  2024-09-30 02:34

  标准

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 研究发现识别miRNA靶标新方法

  研究发现识别miRNA靶标新方法[详细]

  2016-07-27 00:00

  专利

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• Eppendorf 工作站NGS文库构建方案

  高质量的下一代测序 (NGS) 文库的制备是一个复杂的过程，需要投入大量时间、经费和专业知识。珍贵样品通常要处理多日（取决于所用试剂盒），直至准备好文库进行测序。完整的方法由多个部分组成，每个都有特有的精度要求和数百个移液步骤。由于移液精度取决于用户，因此导致了不稳定性，这对重复性产生了负面影响。 Eppendorf epMotion® 自动移液工作站可以用极少的用户干预和设定时间来简化这个费力的过程，即使是对于样本数量较少的操作也可使用。为了尽可能减少编程并让您快速启动和运行，Eppendorf 提供了经过预先优化和试剂厂家认可的 NGS 试剂盒方法，这将获得可重复的优质的二代测序文库。[详细]

  2023-09-15 15:01

  应用文章

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• PolyShooter siRNA/miRNA 转染试剂 P09410

  PolyShooter siRNA/miRNA 转染试剂 P09410[详细]

  2024-09-28 01:11

  操作手册

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 人cDNA**链合成elisa试剂盒使用方法

  本试剂盒仅供研究使用。检测范围：96T20pg/ml-480pg/ml使用目的：本试剂盒用于测定人血清、血浆及相关液体样本中cDNA**链合成(M-MLV)含量。实验原理本试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中人cDNA**链合成(M-MLV)水平。用纯化的人cDNA**链合成(M-MLV)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入cDNA**链合成(M-MLV)，再与HRP标记的cDNA**链合成(M-MLV)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成Z终的黄色。颜色的深浅和样品中的cDNA**链合成(M-MLV)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中人cDNA**链合成(M-MLV)浓度。[详细]

  2018-10-01 10:00

  产品样册

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 基因组DNA文库构建必备实验技巧

  基因组DNA文库构建必备实验技巧基因组DNA文库用途十分广泛,如用于人类及动植物基因组学研究,基因表达调控研究,分析、分离特定的基因片段等.通常情况下,基因组文库构建的基本流程可以归为四大步骤：分离基因组DNA、对基因组DNA作相关的处理、将基因组DNA片段连接入载体、将重组载体转入宿主细胞.一、分离基因组DNA（gDNA）毫无疑问,高质量的基因组DNA对于基因组文库构建是至关重要的.需要通过经验来选择合适的基因组DNA分离方法,在分离过程中保证DNA不被过度剪切或降解,同时也要尽量保证DNA的纯度.二、处理基因组DNA根据研究目的,研究者需要选择合适的载体.不同的载体对基因组DNA的长度有不同的要求,必须选择合适长度的基因组DNA来构建基因组文库.比如,对于黏粒载体,合适的片段长度大约为40kb；对于BAC载体,合适的片段长度平均为120kb-300kb.构建黏粒基因组DNA文库,需要将基因组DNA用注射器抽打来随机剪切DNA；接着用末端修复酶修复DNA,可以提高DNA连接入载体的效率；然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的DNA片段,随后使用胶回收试剂盒回收DNA.构建BAC基因组DNA文库,需要将基因组DNA用限制性内切酶（常用EcoRI、BamHI或者HindIII）来消化基因组DNA,然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段（比如100kb-150kb）,随后透析回收DNA.需要注意：（1）电泳时,要选用合适的DNALadder,以保证电泳后可以准确定位所需分子量的DNA.（2）电泳以后,应尽量缩短用紫外光照射目标DNA的时间,否则会显著降低克隆效率.（3）回收DNA的时候,应该要避免过度离心,以防止DNA被剪切,降低文库质量.三、载体的选择目前,常用的基因组文库载体有黏粒载体、P1噬菌体载体、PAC载体（P1人工染色体）、BAC载体（细菌人工染色体）和YAC载体（酵母人工染色体）.选用何种载体可以参考如下几个因素：1、目标区域的大小：如果基因组的目标区域很小（小于50kb）,那么可以选择黏粒载体甚至λ噬菌体载体.利用现有的商品化的黏粒载体、GX率的包装混合物和合适的大肠杆菌菌株,可以方便的构建黏粒载体文库.如果基因组的目标区域比较大,那么P1、PAC或者BAC就比较合适了.P1操作比较困难,PAC相对简便.BAC载体也是很好的选择,可以利用现有的成熟产品来构建BAC文库,比如商业化的一系列BAC载体及配套试剂盒.如果目标区域非常大（大于250kb）,那么YAC载体就是了.不过,应用YAC载体来构建基因组文库,操作非常繁琐困难.表1各种载体的比较载体容量（kb）宿主导入细胞方式黏粒30-45大肠杆菌转导P170-100大肠杆菌转导PAC130-150大肠杆菌电转BAC120-300大肠杆菌电转YAC250-400酵母转化2、筛选文库的难易程度：黏粒载体一般使用传统的滤膜影印杂交来筛选,但是这种方法对于构建区域图谱及叠连群来说既费力又浪费.大容量载体文库,如P1、PAC、BAC、YAC,以二维阵列保存,既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选,又可以用PCR进行多克隆的群体筛选.而且,使用高容量载体构建文库,可以减少染色体步查的步骤.3、载体拷贝数的考虑：当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时,克隆DNA会发生重组,从而影响克隆序列的保真性和稳定性；而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈.对这一矛盾的解决方案可采用EPICENTRE公司的CopyControlTM克隆系统,CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点.单拷贝载体能提高插入片段的稳定性,而且能在诱导剂的作用下,即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA.四、将基因组DNA片段连接入载体使用连接酶把上述大小合适的DNA片段连接入载体.许多商业化载体已经经过预处理,可以直接使用,无需内切酶消化及脱磷酸化处理.选用连接快、效率高的连接酶,连接反应体系以100μl为宜.注意：BAC载体连接完以后,需要将连接产物做脱盐处理,除去连接反应缓冲液里的盐分.五、将重组载体转入宿主细胞如果构建黏粒文库,需要用包装蛋白来包装上述的连接反应产物,测定包装好的黏粒克隆的滴度,然后转染.挑出重组子,鉴定插入片段的大小.如果文库的大小和质量都令人满意的话,就可以铺板进行文库筛选,或者扩增、保存文库.如果构建BAC文库,应选择电转法,将上述连接产物转入受体菌,涂板长出克隆.获得克隆后需要对BAC克隆的大小进行评估,确定文库大小是否能够满足要求.如果文库大小合适,就可以进行后续操作了.六、文库克隆数的确定基因组DNA文库需要包含足够多的克隆,来保证文库的代表性.一般使用如下的经验公式来确定：N=ln（1-P）/ln（1-f）P是希望得到的覆盖率,f是插入片段大小与基因组DNA大小的比值,N是所需的克隆数.举例来说,用BAC载体构建人类基因组文库,人类基因组大小为3x109bp,插入片段大小为100kb,希望覆盖率99%,那么所需要的BAC克隆数为N=ln（1-0.99）/ln（1-[106bp/3x109bp]）=138,298技术支持资料：材料缓冲液和溶液-碱裂解液I,4°C50mM葡萄糖25mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）配制碱裂解液I约100ml,灭菌,保存在四度.-碱裂解液II,新鲜配置,室温保存0.2NNaOH（从10N的NaOH新鲜制备）1%（w/v）SDS碱裂解液II应该新鲜配制,室温保存.-碱裂解液III,4°C5M醋酸钾,60ml冰醋酸,11.5mlSDW,28.5ml-酒精-70%酒精-异丙醇-酚：氯仿（1：1,v/v）-醋酸钠（3M,pH5.2）-STE,4°C10mMTris-Cl（pH8.0）0.1MNaCl1mMEDTA（pH8.0）-TE（pH8.0）10mMTris-Cl（pH8.0）10mMEDTA（pH8.0）载体与菌株BAC转化的大肠杆菌培养基和抗生素含12.5μg/ml氯霉素的LB平板和液体培养基酶和缓冲液溶菌酶RNaseA,不含DNase限制性内切酶和相应缓冲液核苷酸/寡核苷酸用于脉冲场凝胶电泳（pulsed-fieldgelelectrophoresis）的DNA标准参照物凝胶/点样缓冲液脉冲场凝胶电泳（Pulsed-fieldgels,或者0.5%琼脂糖凝胶）离心机/转头/离心管其他37摄氏度摇床1.BACDNA大量提取方案（参考文献：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案适合从500ml的菌液中提取BACDNA,一般可以产生20-25μg纯化的DNA.方法1.将50μlBAC转化菌的过夜培养物接种到500ml含12.5μg/ml氯霉素的LB液体培养基中,37℃震荡（280rpm）培养12到16小时.2.2500g,4℃,离心15min,收集菌体.3.用100ml冰预冷的STE重新悬浮细菌沉淀.按步骤2方法离心收集细菌.4.用24ml含RNase（100μg/ml）的碱性裂解液I溶解细菌.加溶菌酶至终浓度为1mg/ml.5.加入24ml新鲜配置的碱性裂解液II.盖紧离心瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,冰裕5min.6.加入24ml冰预冷的碱性裂解液III,盖紧瓶盖,轻轻翻转瓶子数次,使内容物完全混匀,置冰上5min.7.15000g,4℃,离心10min,将上清转移到另一离心瓶中,弃沉淀.8.加等体积的酚：氯仿.轻轻翻转离心瓶数次,混匀.3000g,室温离心15min.9.将水相移至另一离心瓶中,加入等体积的异丙醇,翻转离心瓶数次,混匀.10.15,000g,室温离心15分钟,回收核酸沉淀.11.弃上清,用20ml70%乙醇漂洗沉淀.12.弃乙醇,风干使乙醇挥发殆尽.13.小心将BACDNA沉淀溶于0.2mlTE（pH8.0）中.2.BACDNA的小量提取（参考文献：Molecularcloning:ALaboratoryManualThirdEdition）此方案适合从5ml菌液中提取BACDNA,一般可以产生0.1-0.4μg的BACDNA.方法：1.挑取单菌落接种至5ml含12.5μg/ml氯霉素的LB培养基中,37℃剧烈震摇过夜.2.2000g,4℃,离心5min,收集菌体.3.在每个离心管中加5ml预冷的STE,用移液器吹悬细菌沉淀.按步骤2离心收集细菌.4.将菌体重悬于200ul冰冷的碱性裂解液I中.将菌体转移至预冷的微量离心管中,置于冰上.5.向管中加入400μl新鲜配置的碱性裂解液II.轻轻翻转数次,将离心管置于冰上.6.向管中加入300μl冰冷的碱性裂解液III,轻轻翻转数次.将离心管置于冰上5min.7.在微量离心机上以Zda速度4℃离心5min,除去细胞碎片沉淀.将上清移入一新的微量离心管中.室温下加入900μl异丙醇,轻轻翻转数次离心管,混匀.8.立即在微量离心机上室温下Zda速离心5min,使核酸沉淀.弃去上清,用1ml70%乙醇小心漂洗.室温下离心2min,吸去乙醇.室温干燥沉淀5-10min后,将沉淀溶于50μlTE（pH8.0）中.[详细]

  2018-11-16 10:02

  产品样册

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 物联网技术助力环境保护“智慧化”

  物联网技术助力环境保护“智慧化”[详细]

  2016-04-20 00:00

  实验操作

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• DL-胰化蛋白氨基酸技术分析

  DL-胰化蛋白氨基酸技术分析小鼠肾素(Renin)生产elisa试剂盒小鼠白介素12(IL-12/P70)生产elisa试剂盒鱼雌二醇（E2）生产elisa试剂盒小鼠结肠癌抗原(CCA)生产elisa试剂盒PALCAM琼脂平板琼脂糖麦芽汁琼脂猪白介素2(IL-2)生产elisa试剂盒大鼠血管内皮细胞生长因子(VEGF)生产elisa试剂盒大鼠骨成型蛋白4(BMP-4)生产elisa试剂盒DL-胰化蛋白氨基酸技术分析CAS号：54-12-6C11H12N2O2=204.23级别：BR含量：≥99.0%比旋光度：0°(C=1inH2O)氯化物：≤0.020%硫酸盐：≤0.020%铵盐：≤0.020%铁盐：≤10ppm重金属：≤10ppm砷盐：≤1ppm干燥失重：≤0.20%灼烧残渣：≤0.10%性状：白色至黄白色结晶或结晶性粉末，味稍甜，对光敏感。在碱液中稳定，遇强酸分解。微溶于水和乙醇，不溶于氯仿和乙。熔点275～282℃用途：生化研究。营养研究。制备组织培养基保存：RT，避光DL-胰化蛋白氨基酸技术分析[详细]

  2018-11-05 10:00

  产品样册

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 油墨均一性的光谱在线检测

  油墨均一性的光谱在线检测[详细]

  2024-09-19 04:18

  专利

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 光刻胶用色浆均一性解决方案

  光刻胶用色浆均一性解决方案[详细]

  2024-09-14 10:43

  应用文章

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 染料敏化太阳能电池-基本原理及测试

  PurposeofThisNoteThisapplicationnoteispartofaseriesconcerningdyesolarcells.Theoryandvarioustypesofexperimentsarediscussedthatareneededforcharacterizationofsolarcells.Part1ofthisseriesdiscussesbasicprinciplesofdyesolarcells,theirsetup,andunderlyingelectrochemicalmechanisms.Inaddition,characterizationofdyesolarcellsisdemonstratedbymeansofbasicelectrochemicalexperiments.[详细]

  2018-08-30 10:00

  产品样册

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• ZG医学科学院JBC解析抑癌miRNA

  ZG医学科学院JBC解析抑癌miRNA[详细]

  2013-10-12 00:00

  课件

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 电子天平如何选型-转自百度文库.doc

  电子天平如何选型-转自百度文库.doc[详细]

  2016-02-26 00:00

  标准

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• 采用屈服应力测量产品质量的均一性

  采用屈服应力测量产品质量的均一性[详细]

  2008-08-06 00:00

  报价单

  |

  • 
  • 
  • 
  • 

• CMP Slurry均一性的一体化解决方案

  CMP Slurry均一性的一体化解决方案[详细]

  2023-02-23 11:05

  应用文章

  |

  • 
  • 
  • 
  •