核酸电泳技术规范

核酸电泳实验的标准流程与技术核心

在分子生物学及检测行业中，核酸电泳不仅是基础的表征手段，更是质量控制的核心环节。尽管操作看似简单，但要在实验中获得高分辨率、条带清晰且无拖尾的图谱，必须对缓冲体系、凝胶物理特性以及电学参数进行精确控制。

缓冲液系统的选型策略：TAE与TBE的性能边界

缓冲液的选择直接决定了电泳过程中的离子强度和pH稳定性。目前主流应用主要集中在TAE（Tris-Acetate-EDTA）和TBE（Tris-Borate-EDTA）两者之间。

• TAE缓冲液： 分离大分子双链DNA（>12 kb）效果更佳，且后续回收实验的兼容性较好。但其离子强度较低，在高电压长时程电泳中容易发生pH梯度偏移，导致凝胶过热。
• TBE缓冲液： 具有更高的缓冲容量和更强的离子强度，适合分离小分子片段（<1 kb）。其对DNA分子产生的摩擦阻力稍大，因此在分辨超小片段时具有天然优势，但在回收应用中可能抑制后续的酶促反应。

下表对比了两者的核心理化指标：

凝胶浓度与核酸分子量的量化对应关系

琼脂糖凝胶的有效孔径由其质量浓度决定。从业者通常会根据目标片段的大小，调节凝胶浓度，以达到佳的线性分离效果。若浓度过高，大分子难以通过；浓度过低，则凝胶机械强度不足且小分子会发生扩散。

• 0.5% 琼脂糖： 有效分离范围 1,000 bp - 30,000 bp
• 0.8% 琼脂糖： 有效分离范围 800 bp - 10,000 bp
• 1.0% 琼脂糖： 有效分离范围 500 bp - 7,000 bp
• 1.2% 琼脂糖： 有效分离范围 400 bp - 6,000 bp
• 1.5% 琼脂糖： 有效分离范围 200 bp - 3,000 bp
• 2.0% 琼脂糖： 有效分离范围 100 bp - 2,000 bp

对于超小片段（<100 bp）或需要单碱基分辨率的场景，通常会转向聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）。

电场强度与迁移率的物理控制

在实际操作中，电压的选择往往存在误区。许多技术人员为了追求速度盲目提高电压，这会导致凝胶内能增加，产生“U型”条带或条带边缘模糊。

标准的电场强度应设定在 1-5 V/cm（指两电极间的距离，而非凝胶长度）。例如，如果电泳槽两极距离为20 cm，设定电压应在20V至100V之间。高电场强度会降低凝胶的分辨率，特别是对于大于2 kb的片段，因为在高压下，长链DNA倾向于沿电场方向伸展并强行穿过孔隙，丧失了基于尺寸的分选机制。

样本负载与上样工程化建议

上样量是影响条带清晰度的关键非仪器因素。单条带中的DNA载量若超过100 ng，往往会出现条带增宽甚至拖尾。

1. 上样缓冲液比例： 确保Loading Dye与样本充分混匀，甘油或蔗糖的终浓度需足以沉降样本至孔底，避免样本上浮扩散。
2. 点样孔完整性： 梳子拔出时若造成孔壁受损，会产生所谓的“鬼带”或条带歪斜。建议在缓冲液没过凝胶后再拔梳。
3. 上样体积： 液体体积不应超过样孔容量的80%，防止样品在不同泳道间发生交叉污染。

染色与检测技术的灵敏度权衡

虽然EB（溴化乙锭）因其廉价和高灵敏度仍在广泛使用，但实验室安全趋势正全面转向新型荧光染料（如SYBR Safe, Gold等）。

• EB染色： 灵敏度约1 ng/band，但作为强诱变剂，废弃物处理成本高。
• 新型染料： 灵敏度可达0.1 ng/band，且在蓝光激发下即可成像，有效避免了紫外线对目标DNA片段的交叉连接伤害，极大提升了后续转化实验的成功率。

在工业化检测中，应建立标准化的图像分析协议，通过灰度值定量对比（Densitometry），实现对目标产物的半定量或定量分析，确保批次间的质量稳定性。