核酸电泳使用教程

核酸电泳使用教程：从实验配置到高分辨率成像

核酸电泳作为分子生物学实验室的基础定性分析手段，其操作的规范性直接决定了下游克隆、测序及定量PCR结果的可靠性。尽管原理看似简单，但在实际操作中，缓冲液的离子强度、电压梯度的设定以及凝胶浓度的匹配，均会显著影响条带的分辨率与迁移一致性。

核心试剂准备与缓冲体系选择

电泳缓冲液不仅提供导电离子，还起到稳定系统pH值的作用。目前临床检测与科研实验室主流采用的是TAE（Tris-Acetate-EDTA）和TBE（Tris-Borate-EDTA）两种体系。

• TAE 缓冲液：其优点在于双链DNA在其中的迁移率较快，且回收DNA片段时效率更高。然而，TAE的缓冲容量相对较弱，在长时电泳（超过2小时）中易发生电解质耗竭，导致凝胶发热、条带变形。
• TBE 缓冲液：由于硼酸根离子的存在，其缓冲能力更强，在高电压实验中表现更为稳定，特别适合分析小于1kb的小片段核酸。需注意，TBE会抑制某些限制性内切酶的活性，若需进行胶回收，建议优先选用TAE。

琼脂糖凝胶浓度的把控

凝胶浓度决定了分子筛效应的强弱。针对不同分子量范围的目标条带，必须选择合适的琼脂糖比例，以确保佳的分离线性度。以下为常用浓度与DNA佳分离范围的参考数据：

• 0.5% 浓度：适用于 1,000 bp – 30,000 bp 的大片段分离；
• 0.8% 浓度：适用于 800 bp – 12,000 bp 的常规质粒分析；
• 1.0% 浓度：适用于 500 bp – 10,000 bp 的标准PCR产物检测；
• 1.2% 浓度：适用于 400 bp – 7,000 bp 的精细分离；
• 1.5% 浓度：适用于 200 bp – 3,000 bp 的短片段分析；
• 2.0% 浓度：适用于 50 bp – 2,000 bp 的极小片段（如引物二聚体分析）。

在配制过程中，务必确保琼脂糖在缓冲液中完全熔化，直至液体达到完全透明。避免使用微波炉过度加热导致溶剂蒸发，从而改变预设的凝胶百分比。

加样技巧与电泳参数设定

高质量的电泳图谱始于的加样。建议在上样前将DNA样品与Loading Buffer充分混匀。加样量不宜过大，一般孔径建议上样体积控制在10-20μl，以免造成泳道超载导致的条带“拖尾”或“弥散”。

电泳参数的设定应遵循电压梯度原则，而非单纯观察电压值。建议设置电压为 3-5 V/cm（此处的距离指正负电极间的直线距离，而非凝胶长度）。过高的电压会产生焦耳热，导致凝胶融化或条带弯曲（微笑效应）；过低的电压则会导致小片段核酸因扩散作用而使条带变宽，降低分辨率。

核酸染色与影像采集方案

随着实验室安全标准的提升，高灵敏度、低毒性的荧光染料（如SYBR Safe、GoldView）已逐步取代经典的溴化乙锭（EtBr）。

1. 预染法（In-gel staining）：在凝胶冷却至50-60℃时加入染料，操作简便，背景较低。
2. 泡染法（Post-staining）：电泳结束后将胶浸入染料溶液中，条带清晰度最高，且不会干扰核酸的迁移速率。

在凝胶成像系统下观察时，应根据染料的激发波长选择合适的滤光片。通过调整曝光时间，使DNA Ladder与目标条带均处于线性感光范围内，避免由于曝光过度导致的条带细节丢失。

常见异常现象诊断

在实验员的视野中，电泳图谱不仅是结果，更是实验状态的反馈。

• 条带边缘模糊：通常由凝胶未完全凝固或电泳电压过高引起。
• 泳道呈“微笑”状：反映了电泳槽散热不均，中心温度高于边缘。
• 背景荧光过强：可能是染料浓度过高或凝胶中混有杂质。
• 条带位置偏移：需检查缓冲液是否被反复多次使用导致离子强度改变。

通过标准化的操作流程与精细的参数调节，核酸电泳能够为后续的分子生物学实验提供坚实的数据支撑。