核酸电泳工作注意事项

核酸电泳实验的精细化操作与技术避坑指南

在生命科学研究、临床检测及生物医药研发的日常工作中，核酸电泳是一项基础且关键的技术。尽管其操作看似简单，但实验结果的清晰度、条带的分辨率以及数据的可重复性，往往取决于细节的把控。作为从业者，我们需要超越“按部就班”的操作，从电化学原理与高分子物理的视角，深挖电泳过程中的核心注意事项。

凝胶浓度与片段大小的物理匹配

核酸在凝胶介质中的迁移率直接受限于其分子量。选择合适的琼脂糖浓度不仅是为了观察条带，更是为了获得佳的空间分辨率。下表展示了常用琼脂糖浓度与DNA佳分离范围的对应关系，这是实验设计的首要参考：

当分离目标片段小于500bp时，应考虑使用聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）以获取更高的分辨率。若琼脂糖浓度过高，大片段由于电荷密度与孔径不匹配，极易产生明显的带型拖尾或阻滞在点样孔。

缓冲体系的离子强度与稳定性管控

电泳缓冲液（TAE或TBE）不仅提供电导率，更维持了核酸分子的荷电状态和构象。

1. TAE (Tris-Acetate-EDTA)： 适用于大片段（>12kb）的电泳及后续回收实验。由于其缓冲容量相对较低，在长时间或高电压运行中，正负极附近的pH值会发生显著漂移。建议在循环超过3小时的实验中更换缓冲液。
2. TBE (Tris-Borate-EDTA)： 具有更强的缓冲能力和更高的分辨率，特别适用于小片段DNA。但由于硼酸盐可能抑制某些下游酶反应，且在制胶时易产生沉淀，需严格监控工作液的稀释倍数。
3. 离子耗竭警示： 缓冲液若重复使用次数过多，离子浓度下降会导致产热增加，引发条带弥散或“笑脸”效应。建议单次更换工作液后的重复利用次数不超过3-5次。

电流热效应与电压梯度的科学设定

电泳过程中的产热是分辨率的天敌。电压梯度的设定应基于电极间距，而非简单的电压值。通常推荐的设定范围为 1 V/cm 至 5 V/cm（电极间距离）。

• 高压陷阱： 追求快速运行而强行拉高电压（例如 >8 V/cm），会导致电泳槽内部温度升高，不仅使条带边缘模糊，甚至会导致凝胶局部融化或变形。
• 低压优势： 对于需要精确区分大小差异仅为5%的条带，降低电压梯度并延长运行时间，是增强分离效能最直接有效的手段。

样品质控与点样规范

样品中存在的盐离子、蛋白质残留或溶剂残留是干扰条带质量的隐形推手。

• 盐效应： 样品中若含有高浓度的NaCl或KCl，会导致电荷分布不均，出现条带挤压或异常偏移。在复杂基质样本检测前，务必通过纯化柱或透析方式进行脱盐处理。
• 点样量把控： 标准点样孔内，单一条带的核酸负荷量建议在 20 ng 至 100 ng 之间。过量加载（Overloading）会导致孔径局部饱和，产生条带前沿畸变；过低则受限于荧光染料的检测灵敏度，产生假阴性。
• 核酸降解防御： 进行RNA电泳时，环境及试剂的RNase污染防治是核心。建议使用专用电泳槽，并用0.1% DEPC水进行彻底预处理。

荧光染料的选择与成像灵敏度

随着环保要求的提高，新型荧光染料（如SYBR Safe/Green）已逐渐取代EB。不同染料对双链DNA与单链RNA的亲和力不同，其激发波长也存在差异。

• 前染与后染： 前染（将染料直接加入凝胶中）操作简便，但可能因染料与核酸结合影响迁移速度；后染（电泳结束后浸泡）则能提供更准确的片段迁移信息，特别是在定量分析中。
• 背景降噪： 成像时需根据染料光谱调节滤光片。若背景信号过高，应检查是否有染料沉积或紫外光过曝导致的信号淬灭。

在核酸电泳这一经典技术中，对物理参数的敬畏和对操作细节的严谨，是确保实验结论坚不可摧的基石。作为行业从业者，理应在每一次跑胶中追求条带的“教科书级”呈现。