RNase抑制剂——IVD关键原料中的RNase污染去除利器

RNase（Ribonuclease，核糖核酸酶）是一类能够催化RNA降解为小分子RNA的核酸酶，广泛存在于真核、原核生物的所有细胞和组织中，通常有极强活性，RNA样本中微量的RNase污染足以导致其完全降解。实验室中RNase污染的主要来源有：

• 实验中使用的水溶液、反应体系的各组分试剂、枪头等在内的实验耗材；

• 实验大环境的污染，RNase 存在于空气、灰尘和大多数物体表面；

• 实验人员的皮肤或唾液等。

所有组织样品均含有内源性RNase。

RNase的无处不在，使得实验过程中，难以保存RNA样本的完整性，导致实验失败或影响RNA分析的结果。因此，从源头上避免RNase污染十分必要，一方面要严格控制外源性RNase的污染，另一方面要最大限度地抑制内源性的RNase。

1. 操作人员全副武装

在实验过程中戴手套可避免源自人手的RNase污染；触摸皮肤、门把手及普通物体表面后更换手套；

2. 使用专业仪器与试剂

RNA操作专用的移液枪；使用RNase-free的枪头和离心管；使用RNase-free的化合物与试剂；

3. 选择实验操作环境

远离/遮蔽通风孔或开放窗口，走动较少的区域作为RNase-free区域；

4. 其他注意的点

在RNA提取和分析期间，不要进行其他可能引起RNase污染的实验。

1. 样本保存

组织取样后若不直接提取RNA，要及时用液氮迅速冷冻存于-80°C环境，并尽早进行实验，这样可使RNA的降解达到最少。

2. 添加抑制剂

在细胞裂解液中加入RNase抑制剂（RNase inhibitor），使破碎细胞与灭活RNase同步进行，最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的RNase的活性。

常见的RNase抑制剂有焦碳酸二乙酯（DEPC）、异硫氰酸胍、氧钒核糖核苷复合物（RVC）和RNA酶的蛋白质抑制剂（RNasin）。其中，DEPC和异硫氰酸胍具有一定的毒性，RVC对PCR聚合酶有抑制作用，不利于展开后续的实验。RNA酶的蛋白质抑制剂能够特异地与RNase以非共价键结合形成复合体，造成RNase失活，因不具有毒性，不影响后续PCR实验等优势，常被用来减少RNase的污染。目前，RNasin主要用于cDNA合成，体外转录，体外翻译，以及mRNA-protein复合物分离纯化等过程中保护RNA不被降解，还可用于特定RNase活性的鉴定等。

翌圣生物Murine RNase Inhibitor（MRI）是以可溶形式在大肠杆菌中表达纯化的重组鼠源RNase抑制剂，能够广泛抑制各种类型RNase (RNase A, B, C) 可用于RT-PCR/RT-qPCR，解决体外转录中RNA降解问题，抑制RNA分离纯化过程中RNase的活性。与人源RNase inhibitor相比，Murine RNase Inhibitor不含人源蛋白中的两个对氧化非常敏感的半胱氨酸，因而具有更高的抗氧化活性，且更加适合于对高DTT敏感性的实验(如qPCR)。

图1. Yeasen Murine RNase Inhibitor（MRI, Cat#10603ES）产品图。

1. 广谱的RNase抑制活性：可抑制包括RNase A、RNase B、RNase C等在内的RNase。

2. 兼容广泛的反应条件：在pH 5.0至9.0条件下和25℃至60℃的温度下都具有活性，适用于热稳定型逆转录酶（55℃-60℃）。

3. 兼容广泛的下游实验：对SP6、T7或T3 RNA聚合酶，AMV、M-MLV逆转录酶和Taq DNA聚合酶酶活性无影响。

4. 规模化量产：单次生产达20亿U产能，确保了产品的均一性、稳定性和供货的及时性。

5. 批间稳定性：成熟的蛋白表达和纯化平台，符合ISO13485质量管理体系，根据质量标准进行质控检测，保证批次间产品的稳定性。

1. 无核酸外切酶、切口酶及RNase残留

图2. MRI核酸外切酶（20 μl反应体系中加入200 U MRI和0.5 μg λDNA-HindⅢ digest，37℃孵育4小时，琼脂糖凝胶电泳DNA谱带不发生变化）、切口酶残留（20 μl反应体系中加入200 U本酶和0.5 μg质粒DNA，37℃孵育4小时，琼脂糖凝胶电泳DNA谱带不发生变化）检测。

注：N代表阴性对照；1、2、3为3组平行实验。

图3. 20 μl反应体系中加入200 U MRI和0.5 μg 293T RNA，37℃孵育4小时，琼脂糖凝胶电泳RNA谱带不发生变化，则无RNase残留。

注：N代表阴性对照；1、2、3为3组平行实验。

2.  RNase抑制能力媲美进口品牌

图4. 以甲流病毒培养液为模板，使用Hifair® V Multiplex One Step RT-qPCR Probe Kit (UDG Plus)（Cat#13650ES）进行RT-qPCR反应，验证MRI消化RNaseA能力，结果表明翌圣MRI对RNaseA的抑制能力媲美同类国际竞品。

注：Yeasen Control：8 U MRI+0 ng RNaseA；Yeasen：8 U MRI+60 ng RNaseA；R* Control：8 U同类竞品+0 ng RNaseA；R*：8 U同类竞品+60 ng RNaseA。

1. Murine RNase inhibitor是否会影响RT-PCR和qRT-PCR实验？

答：不会影响。经质量测试，每批次Murine RNase inbitior均不含有基因组污染，可适用于RT-PCR和qRT-PCR实验。

2. 在使用Murine RNase inhibitor配制反应体系时，有什么注意事项？

答：配制体系时，在其他可能引入RNase污染来源的组分加入前，RNase inhibitor可首先加入。

3. Murine RNase inhibitor具有核酸内切酶及核酸外切酶活性吗？

答：无核酸内切酶及核酸外切酶活性，有助于提高产物得率。