翌圣GMP级别IIs型内切酶——mRNA药物疫苗研发生产首选

2022-11-25 00:00:00 24阅读次数

扫码分享

限制性内切酶被称为DNA研究中的“手术刀”，自发现以来推动了许多基础生物学研究和商业化应用的发展。在往期的文章中已经对限制性内切酶做了详细介绍：干货|限制性内切酶知多少？今天为大家介绍IIs型内切酶。

特殊的IIs型内切酶

II型限制性内切酶是目前基因工程中最常见的切割酶，特异性识别4-8个核苷酸序列（具有回文结构），切割位点位于识别位点内或附近，酶切后生成粘性末端或者平末端。II型内切酶可细分为11个类型：A, B, C, E, F, G, H, M, P, S和T。

IIs型内切酶属于II型内切酶中较为特殊的一类，突出特点在于：

1. 识别位点为不对称序列，在识别位点下游切割DNA。

2. 酶切位点与识别位点之间的距离是酶依赖的，酶与识别位点结合后，即可切割适当距离DNA序列。

3. 对切割位点序列无要求，可以是任意序列。

4. 特定IIs型内切酶切割两个不同DNA片段所形成的的黏性末端不配对。

图1. Type II与Type IIs型内切酶识别位点与切割序列比较

IIs型内切酶基于以上特性，成为了mRNA生产中质粒线性化的首选酶，同时也开创了Golden Gate组装技术。

IIs型内切酶用于质粒线性化

mRNA药物生产过程中，常使用质粒作为体外转录步骤中的DNA模板，由于环状质粒作为转录模板会产生长度不同的RNA产物，所以环状质粒需要酶切线性化，转录形成特定长度的RNA产物。

图2. mRNA疫苗的示意图及其抗原表达的机制^[^1]

IIs型内切酶的切割位点位于识别位点之外，线性化后的DNA模板上不会留下“疤痕”，体外转录过程中也不会添加不需要的核苷酸。poly（A）尾巴（具有调节mRNA翻译效率功能）可以通过质粒DNA模板限制切割和转录获得，在mRNA产品中加入特定数目的poly（A）。因此IIs型内切酶成为mRNA体外合成中质粒线性化的首选酶。

IIs型内切酶用于Golden Gate组装

IIs型内切酶识别位点是一个非回文对称的序列，切割位点位于识别位点的外侧，因此，当被IIs型内切酶酶切后的两个片段相连时，原来的识别位点不存在，在后续的酶切连接反应中不会被再次切割。Golden Gate组装就是利用IIs型内切酶的这一特性在这些酶的识别序列外侧人为地设计切割位点不同的序列，然后利用同一内切酶产生不同的黏性末端，从而实现酶切与连接在同一管内，一次性无缝组装多个片段。

图3. Golden Gate assembly流程图^[^2]

Golden Gate assembly技术流程：

1. 通过PCR扩增或寡核苷酸合成等技术向目的片段中引入IIs型内切酶（如BsaI、BsmBI等）的识别序列。

2. IIs内切酶识别目的片段和载体上的酶切位点，并在识别位点之外进行酶切。

3. 在连接酶的作用下将目的片段和载体进行无缝连接，实现单片段或多片段重组。

翌圣IIs限制性内切酶-BspQI

BspQI属于Type IIs型内切酶中的一种，可用于mRNA体外合成中质粒线性化，也可用于Golden Gate组装。

产品优势

1. GMP级别：无抗无动物源发酵、纯化工艺。

2. 高酶切效率。

图4. BspQI酶切效果图：以λDNA为模板，分别投入翌圣及竞品N*的BspQI 0.125 U、0.5 U、2 U、4 U，结果显示翌圣不同投入量的BspQI（Cat#10664ES）均可对λDNA进行有效切割。

3. 严格质控：

核酸外切酶、切口酶、RNase酶、非特异性核酸酶、支原体检、宿主蛋白残、大肠基因组残留均严格质控。

图5. BspQI切口酶残留检测：相同反应体系中分别加入10U 翌圣及竞品N*的BspQI和0.5 μg质粒DNA，50℃孵育4小时，琼脂糖凝胶电泳检测翌圣BspQI（Cat#10664ES）切口酶残留低于竞品N*。

图6. BspQI非特异性核酸酶残留检测：相同反应体系中分别加入10U翌圣及竞品N*的BspQI和1 μg λDNA, 50℃孵育1、16小时，琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示翌圣BspQI（Cat#10664ES）无非特异性核酸酶残留。

相关产品推荐

产品定位	产品名称	产品货号
GMP级别Ⅱs型	BspQI GMP-grade (10 U/μL)	10664ES
常规系列Ⅱs型	BspQI限制性内切酶 (10 U/μL)	15202ES
	BsmBI（10 U/μL）	15203ES
	BsaI（20 U/μL）	15204ES
5-15min快速酶切系列	FuniVutTM系列	15001ES-15052ES

参考文献

[1] Maruggi G, Zhang C, Li J, Ulmer JB, Yu D. mRNA as a Transformative Technology for Vaccine Development to Control Infectious Diseases. Mol Ther. 2019;27(4):757-772

[2] 史晏榕, 孙宇辉. DNA 克隆和组装技术研究进展[J]. 微生物学通报, 2015, 42(11): 2229-2237

参与评论

登录后参与评论

全部评论(0条)

推荐阅读

翌圣GMP级别IIs型内切酶——mRNA药物疫苗研发生产首选

限制性内切酶被称为DNA研究中的“手术刀”，自发现以来推动了许多基础生物学研究和商业化应用的发展。在往期的文章中已经对限制性内切酶做了详细介绍：干货|限制性内切酶知多少？今天为大家介绍IIs型内切酶。

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 24
2022-11-25
新品 | 翌圣GMP级别RNA合成酶原料：BsaI

严格质控，高效完成质粒线性化！

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 20
2023-08-25
高标准糖苷内切酶

随着糖蛋白质组学和抗体药研究的迅速发展，糖基化修饰也备受关注。糖基化决定了糖复合物的粘附特性，细胞与细胞和细胞与病原体的接触主要是通过糖与蛋白质相互作用完成的。在IgG中，Fc区Asn297处的保守N-连接糖对其活性也至关重要。

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 20
2023-05-05
翌圣8款mRNA核心原酶获得DMF备案

翌圣生物mRNA合成相关核心酶近日陆续收到美国食品药品监督管理局（FDA）的确认函，继T7 RNA Polymerase获得备案之后，又有八款产品的DMF资料被美国FDA接收，获得备案编号,如需引用DMF编号，请发邮件至marketing@yeasen.com提出授权申请，与您确认后，翌圣生物将向您提供DMF授权书。

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 13
2022-11-14
上新 | 核酸内切酶IV：翌圣DNA损伤修复酶家族又添一员，开启高效修复新篇章！

识别DNA链中的脱嘌呤/脱嘧啶位点（AP位点），通过切割AP位点5'端的磷酸二酯键，产生3'-羟基和5'-脱氧核糖磷酸末端（dRP）

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 22
2024-08-12
翌圣联合和元及近邻共话mRNA药物从研发到生产解决策略

就在12日晚上7点！

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 17
2023-07-10
重组胰蛋白酶携手羧肽酶B、双碱性内切酶助力重组胰岛素生产

小翌为大家准备好了性价比极高的几款无动物源性蛋白酶，为胰岛素生产等生物制药领域提供助力

 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 20
2024-01-04
直播预告 | 翌圣联合左旋星探究优化mRNA原料策略，提升药物质量

8月31日19：00与您相约，不见不散

 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 17
2023-08-31
翌圣高保真酶——让序列扩增不再困难

小翌强烈推荐明星产品2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix(With Dye) 高保真酶预混液（10154），产品以优异的性能在高保真酶市场中杀出重围。

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 13
2023-02-17
翌圣热启动Taq酶——性能优越，广受好评！

Taq酶是应用最广泛的DNA聚合酶，传统的野生型Taq已经无法满足IVD市场的性能需求，需要对野生型Taq进行升级改造，翌圣双向分子酶理性设计与定向进化平台，通过基于蛋白质晶体结构的分子酶理性设计技术，和基于超高通量单细胞分选的分子酶定向进化技术，筛选到高性能Taq酶突变体，经过翌圣反复测试和客户反馈，筛选到的热启动Taq酶，性能优越，广受好评！

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 31
2022-11-04
精彩纷呈！翌圣mRNA实操训练营第一期圆满结业！

干货满满，超有料儿~

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 18
2023-10-24
这个9月，FastDigest内切酶买5支送冰盒啦！

这个9月，FastDigest内切酶买5支送冰盒啦！

赛默飞世尔科技生命科学产品 31
2024-09-12
邀请函 | 翌圣邀您共赴世界疫苗大会！

与您相约，不见不散！

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 21
2024-03-26
翌圣高保真酶，分子克隆的不二之选

PCR技术已经成为生物学实验室的常备技能，荧光定量，基因测序等大家耳熟能详的技术也和PCR息息相关。微量的DNA模板在DNA聚合酶、引物的作用下，以dNTP为原料，经过数十次的热循环过程便可实现指数级的增长，耗时大约1-2小时。一个保真性好的DNA聚合酶对于这种精细又快速的实验至关重要。

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 32
2023-01-13
上新 | T4核酸内切酶V：引领高效DNA损伤修复！

在嘧啶二聚体的5’端切割糖苷键，从而释放出二聚体并留下一个AP位点，随后AP裂解酶活性通过 β 消除切割 AP 位点，与 3'-α、β-不饱和醛和5'-磷酸末端形成1个核苷酸DNA间隙

 翌圣生物科技(上海)股份有限公司 15
2024-08-12
多快好省| Vanquish Duo系统助力mRNA疫苗药物方法开发

赛默飞Vanquish Duo双通道液相与自动方法开发套件联用表征mRNA药物。

赛默飞色谱与质谱中国 89
2024-05-28
精彩继续！mRNA疫苗与药物篇（下）直播预告

生物药关键质量属性表征分析

 赛默飞色谱与质谱中国 461
2022-07-06
mRNA技术 mRNA疫苗质量分析
翌圣生物GMP级PEI转染试剂获得FDA DMF备案

近日，翌圣生物收到美国食品药品监督管理局（FDA）的确认函，翌圣生物Hieff Trans® PEI Transfection Reagent-GMP产品的DMF资料被美国FDA接收，获得备案编号。

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 31
2023-05-08
精品推荐 | 翌圣荧光素酶报告基因检测试剂，信号半衰期高达5h，高通量药物筛选无忧

翌圣荧光素酶报告基因检测系列产品提供简便、高效的定量检测方案。单一组分设计简化了使用流程，高灵敏度与5小时超长信号半衰期的完美结合，满足大规模药物筛选检测需求。

翌圣生物科技(上海)股份有限公司 24
2024-07-19
mRNA药物的研发和关键质控要点概览

SCIEX 的毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统采用激光诱导荧光检测器配合不同的核酸检测试剂盒，可完成mRNA的完整性、加帽率及Poly A 尾分布分析。

徕卡显微系统(上海)贸易有限公司 556
2022-10-17
毛细管电泳PA 800 Plus制药分析系统激光诱导荧光检测器 Biomek i5自动化工作站