干货分享 | 常用的细胞凋亡检测方法汇总

2022-12-16 00:00:00 26阅读次数

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细胞凋亡（Apoptosis）是细胞程序性死亡（Programmed cell death）的一种，由基因严格控制，对于控制细胞生长，发育和更新至关重要。细胞凋亡的激活主要是由两种途径，一种是内源性的由细胞内应激反应或是内部凋亡信号引起线粒体释放细胞色素C（Cytochrome C），激活Caspase家族诱发细胞凋亡；另一种是外源性的由细胞表面的受体接收凋亡信号后激活Caspase家族从而诱发细胞凋亡。可包括一系列特征性变化，如细胞皱缩、核固缩、核碎裂、凋亡小体形成等形态学变化以及DNA特征性片段化、新基因表达、某些生物大分子合成等生物化学变化。

细胞凋亡检测是测定细胞凋亡的过程，通常使用一些特定的实验技术和方法来检测，如：Annexin V-PI双染法、TUNEL方法这些检测技术和方法可以有效地检测细胞凋亡，对于了解细胞凋亡的发生机制，及时防治疾病具有重要的意义。

图1.细胞凋亡过程（From Wikipedia）

细胞凋亡的检测方法正是基于凋亡细胞特殊的形态学改变和生物化学变化而设计的。

原位末端标记法TUNEL

细胞凋亡形成的DNA断裂会暴露DNA链的3’-OH末端，末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）可催化断裂DNA的3′-OH端的核酸聚合反应，加入带有荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素标记的dUTP，显色反应后可特异地进行原位凋亡细胞的检测。正常或增殖细胞几乎没有 DNA的断裂，故很少被染色。

图2.YEASEN TUNEL-FITC试剂盒检测凋亡细胞样本

Annexin V/PI双染法

正常细胞中，细胞膜上的磷酯酰丝氨酸（phosphotidylserine，PS）位于细胞质一侧，细胞凋亡早期，磷脂酰丝氨酸从细胞膜胞质侧翻转到细胞膜外表面。Annexin V是一种Ca²⁺依赖的磷脂结合蛋白，可与外翻的PS特异性结合，用Annexin V（荧光素或生物素标记）作为荧光探针，并与PI同时使用，借助FCM分析染色情况，其中Annexin V-／PI-、Annexin V+／PI+、Annexin V+／PI-、Annexin V-／PI+分别表示正常、晚期凋亡或坏死、早期凋亡和机械性损伤的细胞。

图3.YEASEN Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡

线粒体膜电位变化的检测

处于凋亡早期的细胞，在显微镜下还未出现显著变化时，细胞内线粒体膜电位已经开始改变：线粒体膜通透性增加，跨膜电位下降。膜电位下降被认为是凋亡最早的生物学变化，如果膜电位被破坏，细胞凋亡将不可逆转。一些亲脂阳离子荧光染料，如罗丹明123、JC-1等可与线粒体基质紧密结合，线粒体膜电位下降程度和线粒体聚集染料能力下降程度呈现正相关。

图4.YEASEN JC-1线粒体膜电位检测试剂盒检测膜电位变化[3]

细胞凋亡的Ca2+浓度变化测定

细胞的生命活动都离不开 Ca2+，Ca2+超载时，线粒体通透性转换孔开放，细胞内外Ca2+平衡被破坏，导致细胞凋亡。用 Ca2+特异性荧光探针，如Rhod-2、Indo-1、Fluo-4等对细胞进行标记后，再用 FCM 或荧光、共聚焦激光显微镜检测，可以准确地得出细胞凋亡的生理指标。

图5.YEASEN Fluo-4， AM，细胞膜可渗透钙离子荧光探针[4]

胱天蛋白酶（caspase）活性检测

caspase-3 被认为是各种因素导致凋亡的关键酶，生理状态下它以酶原的形式存在，它的活化预示着细胞执行凋亡程序的开始，是凋亡进入不可逆阶段的标志。目前，坏死细胞中尚未发现有caspase-3 的活化，因此，通过检测 caspase-3 活力强弱可判断细胞是否凋亡或坏死。一般有检测含量和检测活性两种。检测含量是用Western blot、免疫组化或免疫荧光的方法进行Caspase定量或相对定量。检测活性则是利用荧光素偶联的可被Caspase特异性识别的短肽，在Caspase切割短肽后，荧光素会被释放出来，可以根据荧光强度判断Caspase活性。

细胞凋亡相关基因及其产物的检测

细胞凋亡时某些基因表达异常产物，这些基因转录翻译出来的产物可促进或抑制细胞凋亡，如细胞凋亡蛋白家族、凋亡蛋白酶活化因子1（Apaf-1）及 Fas等。这些相关基因及其表达产物的测定可为细胞凋亡检测提供依据。

YEASEN细胞凋亡检测系列产品

产品名称	货号	规格
Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒	40302ES20/50/60	20T/50T/100T
Annexin V-EGFP/PI 细胞凋亡检测试剂盒	40303ES20/50/6	20T/50T/100T
Annexin V-Alexa Fluor 647/PI 细胞凋亡检测试剂盒	40304ES20/50/6	20T/50T/100T
Annexin V- Alexa Fluor 488/PI 细胞凋亡检测试剂盒	40305ES20/50/6	20T/50T/100T
TUNEL Apoptosis Detection Kit(FITC) TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)	40306ES20/50/6	20T/50T/100T
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Alexa Fluor 488)	40307ES20/50/6	20T/50T/100T
TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(Alexa Fluor 640)	40308ES20/50/6	20T/50T/100T
Annexin V-PE/7-AAD Apoptosis Detection Kit Annexin V-PE/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒	40310ES20/50/6	20T/50T/100T
JC-1 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-1线粒体膜电位检测试剂盒	40706ES60	100T
JC-10 Mitochondrial Membrane Potential Assay Kit JC-10 线粒体膜电位荧光探针	40752ES60	100T

参考文献

[1]李媛媛, 吴洪娟. 双氢青蒿素体外诱导人乳腺癌细胞凋亡的电镜研究[J]. 电子显微学报, 2015(02):138-141.

[2] Suman S,Pandey A, Chandna S. An improved non-enzymatic “DNA ladder assay” for more sensitive and early detection of apoptosis[J]. Cytotechnology, 2012, 64(1):9-14.

[3] Liang W L, Xiao L, Gu H W , et al. Solid lipid nanoparticle induced apoptosis of macrophages via a mitochondrial-dependent pathway in vitro and in vivo[J]. International Journal of Nanomedicine,2019,14:3283-3295.

[4] Fu R, Xia Y, Li M,et al.Pim-1 as a therapeutic target in human lupus nephritis[J]. Arthritis and Rheumatology, 2019, 71(8).

[5]何玉婷,杨雯,王改琴,等. 细胞凋亡主要检测方法及其应用[J].医学综述,2019,25(04):156-160+165.

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