以In vivo CAR-T为代表的体内细胞治疗正在成为细胞治疗领域的重要迭代方向，吸引了多家国际大型制药企业的战略投资。国内创新企业也在积极布局In vivo CAR-T，并已在早期临床试验中获得国际前沿的积极信号。
近期，Cytiva思拓凡组织了以“激活创新引擎，提速In vivo CAR-T价值转化”为主题的闭门研讨会，邀请多家国内和海外行业头部企业参与，通过行业智库的形式深入探讨这一新兴技术方案所带来的挑战与机遇，旨在加速临床转化并为未来商业化奠定基础。
本文基于专家观点，结合行业最新动态，对In vivo CAR-T技术进行系统性综述。
1、行业现状与体外CAR?T的临床基准和产业化挑战
体外CAR?T（CD19、BCMA）在B细胞恶性肿瘤已建立“可治愈”级别的临床认知，并在自身免疫（SLE、肌炎、系统性硬化症等）通过免疫重置（深度B细胞清除 +na?ve B细胞再生）呈现持续缓解的潜力。
然而，行业层面的四大掣肘长期存在：患者定制化生产、认证中心有限、化疗清淋与高COGS（成本结构）——导致真实世界可及性显著受限（美国只有约20%合格血液肿瘤患者能进入商业化治疗）。这一判断在2025年Carl June团队的Nature Reviews Drug Discovery综述文章中反复被强调 [1]。
2、如何界定未满足的医疗需求
需求刻画：对于血液肿瘤，目标是更早线的MRD清除/治愈意图、更广泛的可及性；在自身免疫，要达到药物停用级别的免疫重置；实体瘤需要深度肿瘤内药效 + 微环境逆转（跨越免疫排斥与抗原异质）。
靶向生物药（TCE/ADC/双抗）和体外CAR-T的局限：基于抗体的生物药尽管即用型与规模化优势显著，但在复发/难治血液病的持久性常受“抗原逃逸 + T细胞耗竭”限制；实体瘤因肿瘤微环境（TME）屏障 + 递送/渗透不足，往往只能获得短期/边际收益。体外CAR?T的路径（采集?制备?回输）与化疗清除依赖导致高成本、低可及性，另外在自身免疫应用上面对高安全门槛safety bar的限制。
In vivo CAR的补位逻辑：瞬时mRNA?CAR可按需给药（比如两次或多次紧凑输注），实现可重复给药与门诊化的路径；整合型慢病毒In vivo CAR可根据抗原负荷自调节扩增/持久性，更适合高负荷肿瘤场景—但需配合谱系特异启动子与安全开关来管理长尾风险。
两种技术路线均可以实现大规模生产，不需要（也不能）进行清淋，从而有望在COGS、临床可及性等多方面实现技术迭代从而解决未满足的医疗需求。与会专家的共识是In vivo CAR-T需要在安全边界、疗效深度（safety bar and efficacy bar）和生产效率之间找到真正的平衡点。针对肿瘤，专家的愿景是能够实现治愈。
3、从最早的体内T cell programming到“First-In-Human”信号：证据链如何搭建
初期探索：最早的In vivo CAR-T临床前研究来自于2017年Fred Hutchison Cancer Center的研究团队，采用可降解高聚物递送piggyBac转座子表达CD19 CAR [2]。Paul-Ehrlich Institute研究团队在2012年通过去靶向/重定向慢病毒包膜（如VSV?G突变 + T细胞配体）使载体在体内选择性转入T细胞，以实现CAR基因的稳定整合表达；并于2018年在小鼠模型上证实B细胞清除与抗肿瘤活性 [3]。
NHP强证据：Umoja在2024年Blood论文中显示了VivoVec平台的巨大潜力：不经淋巴清除，单次给药即可在NHP体内生成抗CD20 CAR?T，使循环 B 细胞>10周完全清除；CAR? T 细胞峰值可达~65%（循环 T 细胞），验证了多结构域融合蛋白（MDF：CD3+CD80+CD58）在体内转导与协同激活的增益作用 [4]。
慢病毒in vivo CAR（整合型）：Interius的INT2104（anti-CD20）于2024年启动FIH（INVISE，全球多中心一次输注，无预处理），强调CD7靶向以在体内同时生成CAR?T与 CAR?NK；2025年注册记录显示试验正在招募与全球扩展[5]。EsoBiotec/AZ的ESO?T01（anti-BCMA）在中国IIT的队列（n=4）全部应答，其中2例达完全缓解，但也观察到双相CRS与个别ICANS事件，提示临床管理路径需根据体内CAR的动力学进行更新 [6]。
基于的RNA?LNP（瞬时型）In vivo CAR：Orna的环状RNA（oRNA）+ 免疫趋向LNP在 NHP显示单剂量24 h内外周/脾/骨髓B细胞降低75–80%，且7天维持；NHP最高95%B细胞清除[7]。Create Medicines（原Myeloid Therapeutics）在SITC2025公布 MT?302（TROP2，髓系编程）首例人体：27例晚期实体瘤，重复给药可行，可管理的低级CRS（无≥3级），肿瘤内检出CAR?髓系细胞与IFNγ/CXCL9/10上调；CXCL9:SPP1比值与肿瘤负荷变化相关，并在HR?乳腺癌出现确证PR（16个月、20次给药）。这组数据首次在人群中展示了体内CAR在实体瘤的渗透与微环境重塑。
图1：基于病毒和LNP的两种主要In vivo CAR-T的载体和载荷的对比 [1]
来自中国的自身免疫里程碑：深圳虹信生物的HN2301（CD8?tLNP CD19 CAR mRNA）在新英格兰医学杂志发布SLE首批人体数据：无需淋巴清除，低剂量即可在6小时内将 CD8+中CAR?比例推至~60%，造成7–10天循环B细胞完全清除，且SLEDAI-2K三个月改善最高20分；未见≥3级CRS、神经毒性或显著肝酶升高。这为体内 mRNA?CAR在免疫病的安全性窗口与可重复给药设计奠定基础 [8]。
4、技术版图：递送系统×载荷类型的二维组合
在In vivo CAR-T应用中，递送系统和载荷类型的设计至关重要。本次论坛专家团的共识是递送平台必须确保精准靶向，以大幅减少脱靶效应并实现最佳治疗指数（therapeutic index）；同时，载荷设计需要精细调控表达强度和持续性，以在维持疗效的同时避免毒性。靶向特异性是关键，确保CAR-T的生成仅发生在预期的免疫细胞群体中，从而降低系统性暴露风险。
同样，载荷设计必须在强效CAR表达与受控持久性之间取得平衡，以避免失控增殖或免疫相关不良事件。这些因素共同构成安全、高效且可扩展的体内CAR-T治疗的基础。
图2：in vivo CAR-T的生态圈：重要技术路线和临床进展 [1]
4.1 递送系统
在In vivo CAR-T的开发中，递送系统决定了靶向特异性、表达稳健性与安全边界。当前主流路径包括病毒载体与非病毒纳米递送两大类。
A. 病毒载体
慢病毒（LVV）：通过包膜工程实现对T细胞的选择性转导，常见策略包括在颗粒表面共展示TCR信号与共刺激分子（如CD3×CD80×CD58 的多域融合蛋白）以提高与循环T细胞的结合、激活与整合效率，无需预处理即可体内生成CAR-T。以VivoVec和ENaBL技术为例整理体内LVV的设计思路：
图3：Esobiotec的ESO-T01设计思路 [6]
T细胞特异性靶向模块：在病毒包膜上整合纳米抗体（NanoBody）或配体复合体，实现对T细胞表面标志（如CD3/CD4/CD8）的精准识别。确保载体在体内主要进入 T细胞，减少肝脏或髓系细胞脱靶转导。
多域融合配体（MDF）的病毒颗粒表面展示：VivoVec 的核心创新不是传统VSV?G假型化，而是在慢病毒颗粒表面展示一个多域融合配体（MDF），同时提供TCR激活信号（anti?CD3 scFv）与共刺激信号（CD80/CD58 结合域），以在循环T细胞上实现选择性结合?激活?转导的一体化流程，从而在无需淋巴清髓的情况下体内生成CAR?T。MDF的双信号共展示使颗粒与T细胞膜形成高亲和多点接触，提升吸附驻留时间与膜重排，并通过局部预激活增加慢病毒进入效率（内吞/膜融合），从而把“配体特异性 + 转导效率”直接耦合到同一分子界面。这也是在体内获得高比例CAR?T的工程原因之一（对比仅有抗CD3 的表面展示，加入CD80/CD58后转导与功能指标显著增强）。
免疫屏蔽：EsoBiotec的ENaBL平台在lentiviral设计中引入CD47高表达和 MHC-I敲除两个关键免疫调控元件，核心目的在于免疫屏蔽（immune-shielding），提高体内递送效率并降低免疫清除风险。CD47是“don’t eat me”信号分子，可与巨噬细胞上的SIRPα结合，抑制吞噬作用。在lentiviral包膜上表达CD47，减少病毒颗粒被单核-巨噬细胞系统（MPS）清除，提高载体在血液循环中的稳定性，延长半衰期，增加T细胞转导机会。MHC-I分子是细胞免疫识别的关键，病毒颗粒表面若呈现MHC-I，易被 CD8? T细胞识别并清除。在表达细胞系维度敲除或减少MHC-I，降低载体表面的MHC-I表达，从而减低被细胞毒性T细胞攻击的风险，减少免疫排斥，增强安全性。
腺相关病毒（AAV）：AAV以核外环状或串联外显子体形式长期存在，但在有丝分裂细胞（例如effector T细胞）中存在表达稀释与表观遗传沉默问题，且衣壳免疫反应可能导致转导细胞被免疫清除；因此在T细胞稳态表达场景中，往往需要与位点整合或编辑系统组合以满足持久表达与一致性，如Azalea Therapeutics的AAV（donor template）+EDV（基因编辑器）的策略（见下文）。
工程化VLP/腺病毒系统：Ensoma公司以helper?dependent腺病毒样颗粒（VLP）为基础，优先靶向HSC（CD46?）并可携带高达~35 kb的多基因载荷，支持以谱系特异启动子实现HSC派生的多系CAR免疫细胞（CAR?M、CAR?NK、CAR?T）持续生成与协同，从而在实体瘤中实现免疫生态重塑与长期监视；目前人体数据尚早，已在多模型中展示稳定整合与长期表达的原型 [9]。
另外以诺奖获得者Jennifer Doudna博士领导的Enveloped Delivery Vehicle （EDV）路线也值得关注。EDV是一种包膜化递送系统，采用类似病毒的结构，但不含复制能力。它将Cas9蛋白+sgRNA封装在膜包裹颗粒中，结合抗体片段或配体实现细胞特异性靶向，主要针对T细胞。分子设计上有双层精度：细胞选择 + 位点特异整合。
第一层：EDV选择性递送CRISPR-Cas9到T细胞，避免肝脏等非靶细胞脱靶编辑。第二层：与T细胞嗜性AAV协同，提供无启动子HDR模板，将CAR基因插入TRAC位点（TCRα恒定区），在内源性启动子调控下表达，提升耐久性、安全性。在免疫完整动物模型（包括人源化小鼠），EDV+AAV双载体平台实现TRAC位点精准插入CAR基因，并在体内生成功能性CAR-T [10]。在小鼠模型中单次给药实现~50%体内CAR-T生成和完全B细胞清除。以此技术孵化的Azalea Therapeutics已完成$82M融资，在 ASGCT/ASH/SITC上展示了TRAC CAR-T精准插入的动物数据，并计划在12–18个月内启动CD19 In vivo CAR-T临床试验。
图4：Jennifer Doudna研究组/Azalea Therapeutics的enveloped delivery vehicle (EDV)递送平台（来源：Access Health International）
B.非病毒系统
免疫趋向 LNP（不修饰表面）：利用蛋白冠与髓系吞噬受体的相互作用，实现在体内将髓系细胞编程为CAR?M，并在实体瘤中观察到肿瘤内渗透、IFNγ/CXCL9/10 诱导的“炎性重塑”。MT?302的首次人体剂量爬坡显示：可管理的低级CRS（≤G2，~52%）、无≥G3 CRS、MTD=0.10 mg/kg（无类固醇预处理），并出现HR?乳腺癌确证PR（治疗16个月、累计20次给药）及配对活检证实CAR?髓系穿透与 T 细胞募集，构成实体瘤in vivo CAR重要的早期临床信号 [11]。
靶向LNP（tLNP）：通过在LNP表面偶联抗体/纳米抗体/DARPin，实现对CD8或CD5等T细胞标志的特异递送，使mRNA在体内直接重编程T细胞生成CAR-T。
Science（2025）报道的CD8?L829?tLNP在NHP中实现血液与淋巴器官的近乎完全B细胞清除，且再生的B细胞以na?ve B cells为主，提示“免疫重置”；并显示肝脏脱靶表达降低、脾/淋巴组织分布增强，为外肝递送与耐受性提供了坚实依据 [12]。需要强调的是，配体密度存在“倒 U 型”效率曲线：过低影响结合与内吞，过高则因补体激活与蛋白冠变化造成递送效率下降与安全性问题；近期有研究提示常用偶联化学（如DBCO?click、maleimide）可显著影响补体介导的毒性与生物分布（设计时需规避“过度修饰”与游离功能团） [13]。
分子工程上通常使用带官能团的PEG?脂质（如DSPE?PEG?maleimide/DSPE?PEG?NHS/DSPE?PEG?azide）把抗体、纳米抗体或 DARPin稳定地锚定到LNP表面。PEG-脂结合了亲水性的PEG链和疏水性的脂质锚，能够自发插入纳米颗粒膜，并在表面形成水化层，从而实现立体稳定化并赋予免疫隐形特性。
图5：Capstan的tLNP结构示意
常用偶联化学与“位点?取向”控制：
巯基?马来酰胺（thiol?maleimide）：与抗体半胱氨酸（工程引入或还原后）定向连接；但需防止游离maleimide与血浆白蛋白交联导致补体激活与生物分布偏移（参考Advanced Materials文献） [13]。
NHS?酯?胺（NHS?ester）：与抗体赖氨酸多位点连接，工艺易行但取向随机、可能降低结合位点可及性；设计上常辅以糖基位点定向（Fc glycan改造）或工程化Cys以提高可控性。
应力促进的环加成（SPAAC，DBCO?azide）：温和、无需金属催化，常用于脂质?DBCO-抗体?azide的生物正交连接；但DBCO在某些条件下可引发表面抗体聚集并与补体轴产生不良互作，需优化反应条件与纯化。
Table 1： 抗体-LNP偶联方式的对比
其他纳米颗粒（如HPAE等）：通过调控pKa、可降解性与内吞逃逸，增强肝外递送与耐受性；相关研究尚处于早期阶段。
4.2 载荷类型
载荷的类型与构型决定了In vivo CAR的表达强度、持续性与可控性，进而影响治疗指数与安全边界。
病毒载体的载荷：VivoVec采用二代CAR结构（scFv?hinge?TM?co?stimulatory?CD3ζ），并通过体内转导在T细胞上获得功能性抗B细胞靶标（文献中以CD20为例）；在NHP体内观察到全身与淋巴组织的B细胞枯竭且无需预处理，符合“快速起效 + 持久整合”的范式。虽然不同适应症的具体共刺激域可能可调，但在体内直接生成功能CAR?T并维持持久效应是其分子工程的关键目标与已证事实。
Esobiotec与Chromatin Bioscience合作开发合成T细胞特异启动子（Synthetic Promoter），利用chromatinLENS平台从暗基因组筛选高特异性调控元件，驱动CAR基因仅在T细胞中表达，避免非靶细胞表达，提升安全性和治疗指数。HSC?VLP为代表的大载荷DNA递送平台在动物模型中已展示多系CAR的持久表达与实体瘤抑制原型，提示在体内整合+多模态免疫重编程上的潜力。Azalea Therapeutics的AAV（donor template）+EDV（基因编辑器）的策略在小鼠模型中单次给药实现~50%体内CAR-T生成和完全B细胞清除。
LNP载荷:
mRNA format：线性 vs 环状（oRNA）：线性mRNA具备起效快、可调剂量/重复给药的优势，但半衰期短、先天免疫感知较强；环状oRNA通过IRES/环化构型显著延长翻译与降低免疫感知。在NHP的单剂或两剂方案中，oRNA?LNP的抗CD20/ CD19 panCAR可在24–72小时内实现75–95%的B细胞清除并维持至少7天，同时在脾/骨髓等淋巴组织显示持续效应，验证了短程、可重置的体内CAR路线（无淋巴清髓）。这类载荷为自身免疫提供了可门诊、可重复的免疫重置路径，与tLNP的细胞特异递送相结合正快速进入临床探索。
CAR mRNA瞬时表达 vs 基因编辑（敲入）长期表达：仅递送CAR mRNA有利于CMC 简化与可重复给药；而CRISPR/基因写入/表观遗传编程可实现位点精准整合与多重改造（如PD?1/CTLA?4失活、TRAC位点敲入），并能在不引入双链断裂的前提下实现耐久的表型编程，为在体内递送编辑器提供了安全性与特异性的方向。
以Stylus公司通过LNP递送序列特异性重组酶以实现CAR精准整合至T细胞基因组 [14]。Tessera使用gene writing技术将CAR定点写入特定T细胞位点（比如TRAC）；临床前小鼠模型数据显示~30-60%T细胞编辑效率和功能性CAR-T扩增 [15]。NanoCell Therapeutics则是采取了DNA minicircle + 转座子mRNA的载荷路线，前者编码CAR，后者协助基因组插入，采用tLNP递送，靶向CD3/CD7,在人源化小鼠模型上得到早期验证 [16]。
5、CMC与法规路线图
“身体就是反应器”带来的挑战和机遇
LVV路线的工艺要点
用于体内CAR-T的LVV载体需要精准设计并控制病毒颗粒表面功能元件，包括包膜蛋白、靶向分子以及免疫屏蔽因子（如CD47）。这些元件的表达水平和比例必须保持在合理范围，以确保体内功能一致性。传统瞬时转染工艺通常需要至少五种质粒，导致不同病毒颗粒间元件表达不均，显著降低产品纯度。因此，LVV工艺的首要CMC挑战是从源头控制纯度。
图6：用于体内CAR-T的LVV载体元件表达不均一带来的纯度和工艺挑战
（来源:深研生物）
目前的更优策略是细胞株开发：通过构建稳定转染细胞株并筛选高表达且元件比例最优的克隆，实现LVV纯度和产量的源头控制，降低下游纯化压力。深研生物的EuLV技术通过高通量细胞株构建与筛选，显著提升LVV的产品质量一致性和工艺可控性。
LVV整体工艺关键控制要点包括：
生产细胞系与原材料：建立稳定细胞库，确保身份鉴定、稳定性、无菌及外源病原检测合格；在工艺开发阶段建立产品质量与关键原材料的关联。
培养体系选择：贴壁培养简化澄清与下游负担，悬浮体系则具备扩增与放大的易操作性，需根据整体工艺平衡进行选择。
上游与下游工艺：优化细胞密度与培养条件；通过物理滴度（p24 ELISA，VP/mL）和感染滴度（TU/mL）监控收获窗口；下游采用多种层析及过滤去除HCP、DNA、残留试剂及颗粒聚集，确保颗粒质量可控。
图7：基于悬浮培养的LVV工艺解决方案
5.2 LNP路线的工艺要点
用于体内CAR-T的LNP工艺路线，核心在于实现靶向特异性、载荷稳定性和批次一致性。与LVV不同，LNP是化学组装体系，涉及脂质、配体、核酸载荷等多组分，比例偏差可能会影响递送效率和安全性。
主要CMC挑战包括：
脂质组分与结构均一性：离子化脂、辅助脂、胆固醇和PEG脂比例直接影响靶向(或去靶向)、粒径、pKa和内吞逃逸能力。工艺需控制粒径分布（PDI）、表面电位等属性。脂质的原材料来源尤其需要注意，其内可能含有活性杂质。另外有多个报道指出离子化脂质可能在空气或氧化条件下发生氧化并形成活性醛类。醛类会与RNA核苷碱基发生交联，导致生成失活的RNA加合物。
图8：离子化脂中的杂质以及其氧化降解物与mRNA反应生成的失活加合物（Cytiva内部数据）
载荷完整性和包封：mRNA或环状RNA（oRNA）需在清洁无RNase条件下操作，避免降解。需通过RiboGreen assay封装率测定并进行理化分析（HPLC、CE），确保活性核酸比例和完整性。
配体偶联控制：tLNP通常通过PEG-脂质锚定抗体或纳米抗体，偶联化学（如 maleimide、DBCO）需严格控制反应条件，避免游离反应物导致补体激活或免疫毒性。需建立配体密度的定量方法，确保批次间一致性。
工艺控制：微流控混合工艺需保持剪切速率和流量比稳定，避免粒径漂移；下游则需要采用超滤（TFF）或层析去除游离脂质、未偶联抗体和残留溶剂，确保纯度和安全性。
图9：采用分子排阻层析分离tLNP和游离配体（Cytiva内部数据）
5.3 法规框架与趋势
与会的法规专家指出，创新发展与法规适配必须并行推进；只有在建立与技术特性匹配的监管路径后，体内CAR-T才能真正从探索性试验走向大规模临床应用。
2025年9月，《生物医学新技术临床研究和临床转化应用管理条例》（国务院令第818号）正式发布，标志着我国生物医药创新临床试验监管进入全新阶段，为包括CAR-T在内的前沿技术的临床研究和转化应用建立了明确的法律框架，提供了顶层制度设计。该条例不仅规范了临床研究的备案、实施和风险管理，还强化了全过程安全与伦理要求，确保创新与安全并重。
与此同时，研究者发起的临床试验（IIT）在体内CAR-T等新技术探索中扮演重要角色，其伦理审查成为监管重点。科学委员会与伦理委员会的双重审查机制，旨在保障研究的科学合理性和受试者权益，推动技术从实验室走向临床的合规路径。如何在创新速度与伦理底线之间取得平衡，成为监管机构和行业共同关注的核心议题。
6、资本与产业化信号
尽管技术仍有挑战（递送靶向特异性、载荷稳定性、免疫安全窗），但IIT的早期人体数据与头部药企的前置布局表明：围绕自身免疫和肿瘤的双线推进，将是接下来年全球与中国产业化的主旋律。中国凭借IIT机制、CMC能力与跨境协作，在COGS、可及性与规模化的核心维度上具备提前占位的现实窗口。与会专家分享了借助外部研发力量，跨生态圈范围合作，加快In vivo CAR-T产品开发的经验，并利用包括IIT和国务院818文件的顶层设计，形成first-in-human信号—工艺优化—应用扩展的循环提升机制。
图10：截至2025年11月主要的In vivo CAR-T并购和战略合作事件
7、从全球到中国：Cytiva的赋能
Cytiva长期深耕生物制药领域，支持了全球约80%的生物药生产以及绝大多数细胞治疗产品的工艺开发与制造。在in vivo CAR-T赛道，Cytiva的技术工具箱覆盖从细胞培养到纯化、从mRNA原液到LNP包封的全流程，能够为这一新兴技术提供端到端支持。从全球首例公开发表的人体内基因编辑 [17]到成功获得ARPA-H EMBODY (In vivo CAR-T)科研资助，Cyitva始终在引领先进疗法创新之路上 [18]。
面对In vivo CAR-T技术的快速演化，Cytiva在病毒载体与非病毒载体两条路线同步布局：
病毒载体方向：在中国与深研生物建立战略合作，推广EuLV稳转细胞株开发服务，从源头解决LVV工艺的产量与纯度一致性挑战，降低下游纯化压力。
LNP方向：构建从自主知识产权脂质与配方到工艺开发与GMP生产的一体化能力，涵盖微流控工艺、配体偶联优化、下游纯化和分析控制，确保递送效率与安全性。
当前行业尚未形成通用的“平台化工艺”，更优的CMC策略是基于产品特性量身定制的工艺优化，以保障药物的安全性和功效性。Cytiva上海Fast Trak Center已建成端到端的开发与生产体系，具备从质粒到mRNA、从病毒载体到tLNP的工艺储备与GMP能力，并配备资深开发团队，能够为中国In vivo CAR-T创新企业提供一站式CMC解决方案，加速从临床验证到产业化落地的全链路进程。
Cytiva扎根中国服务中国，将继续加大在中国的本土化和创新的进程，为创新药企提供优质的技术、材料、和服务。在充满变化的行业环境中，Cytiva始终保持战略定力，并承诺为开发者提供稳定可靠的供应保障（security of supply）和符合国际标准的质量体系。
这不仅确保创新企业在快速迭代中拥有坚实的工艺与质量基础，也为中国药企在全球市场的注册与合作提供关键支持，助力其实现“出海”战略目标。
未来，In vivo CAR-T的成功不仅取决于技术突破，更依赖于产业链协同与全球合作。Cytiva与行业伙伴的深度合作，将成为推动这一新兴疗法加速落地的关键力量。
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