关键词：差示扫描量热分析(DSC)、寡核苷酸疗法(ON)、反义寡核苷酸(ASO)、小干扰RNA(siRNA)、DNA、RNA、浓度效应、配方开发
摘要
短期热稳定性测试对于保障寡核苷酸类药物产品质量并支持注册备案至关重要。TA 仪器创新的RS-DSC快速筛选差示扫描量热仪是一款测量寡核苷酸(oligos)热稳定性的有效工具，可用来评估其热稳定性与不同缓冲液成分、寡核苷酸浓度及链长的相关性。
引言
TA仪器经典的Nano DSC差示扫描量热仪是一款用于监测中短链寡核苷酸在低浓度下热稳定性的成熟工具[1,2]。其毛细管样品池的灵敏度更高，但在低浓度(<1mg/mL)下测定的寡核苷酸稳定性可能无法充分反映生物治疗制剂在更高配方浓度下的稳定性。而近年新推出的RS-DSC快速筛选差示扫描量热仪则搭载突破性的微量热技术，可直接使用低体积、高配方浓度样品进行大分子热稳定性筛选，无需样品稀释和清洗。
寡核苷酸药物(ONs)是一种新兴药物类别，旨在通过调节基因表达来治疗疾病[3,4]。最常见的ONs药物包括反义寡核苷酸(ASOs)和小干扰RNA(siRNA)药物。尽管ASO和siRNA类药物通过不同机制发挥疗效，但二者均通过Watson-Crick碱基配对与靶向RNA结合来激活或抑制基因表达。熔解温度(Tm)指一半DNA分子双链结构解离为单链时的温度，是设计寡核苷酸药物序列的关键参数。研究表明，许多DNA结合药物的治疗效果与其复合物的热力学特性密切相关[5]。
差示扫描量热分析(DSC)是一种用来获取核酸、修饰核酸及核酸-配体相互作用热力学特性的宝贵工具(图1)。除了直接测量核酸复合物的熔解温度外，它还能直接测量热焓(ΔHcal)，理解吉布斯自由能变化(ΔG)和熵变(ΔS)。通过DSC技术，可清晰阐明核苷酸链长度、核苷酸浓度以及配方条件(包括缓冲液、赋形剂、pH值和离子强度)的影响。
图1：通过差示扫描量热分析获得的DNA变性曲线示意图。
在变性(熔解)前，寡核苷酸保持其经典双螺旋结构；
当温度升高时，其结构转变为单链盘绕形式。
对两种市售ASO药物的衍生物进行了评估。EXONDYS 51? Eteplirsen是一种长度为30个核苷酸的磷酰二胺吗啉代反义寡核苷酸，于2016年获批用于治疗杜氏肌营养不良症。该反义寡核苷酸制剂浓度为50mg/mL，通过静脉输注给药[6]。
TEGSEDI? Inotersen是一种长度为20个核苷酸、具有gapmer结构的反义寡核苷酸，获批用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白介导的淀粉样变性(hATTR)患者的多发性神经病变。其制剂浓度为200mg/mL，每周皮下注射给药[7]。
实验方法
为进行量热分析，将11μL寡核苷酸样品直接移入一次性玻璃微流控芯片(MFC)中加样后，使用玻璃盖片密封微流控芯片，确保样品在加热至100°C的过程中保持完好。将密封好的微流控芯片置于RS-DSC的样品侧。将一个可重复使用的聚醚醚酮(PEEK)芯片置于参考侧。该量热仪可在20-100°C温度范围内，以1或2°C/min的预设扫描速率同时处理多达24个样品。采用一次性微流控芯片，一个工作日通常可完成多达96份样品的检测。
通过TA仪器RSDSCRun软件操作TA仪器RS-DSC，每次扫描开始前在初始温度下平衡30分钟。在20-100°C的温度范围内，以1或2°C/min的速率扫描每个样品。
使用NanoAnalyze?软件(4.1.0版)处理数据。自动检测差示扫描量热图中的基线、Tmax和Tonset参数软件可导出自动分析生成的表格数据用于轻松对比。
结果与讨论
不同浓度寡核苷酸的筛选
热稳定性是寡核苷酸药物产品的一项关键质量属性，受链长、G:C含量、浓度及其缓冲体系的离子强度影响[8]。差示扫描量热仪(DSC)是表征生物分子热力学特征的首选工具。而RS-DSC兼顾通量浓度适应性，可实现制剂浓度下寡核苷酸候选药物的快速筛选。
对获批ASO药物inotersen和eteplirsen的天然DNA类似物在不同浓度下进行了三次重复数据分析。本研究筛选的浓度最高约为70mg/mL，而某些获批核酸疗法制剂浓度可达200mg/mL[4]。RS-DSC采用一次性微流控样品芯片，专为容纳此类高浓度制剂而设计，支持直接对未稀释药物进行热稳定性测试。
图2：A) 20碱基对DNA双链体与B) 30碱基
对DNA双链体在Gibco DPBS(pH7.4)缓冲液中
不同稀释度下的曲线叠加图
寡核苷酸的熔解温度对应50%的螺旋双链体分离为单链盘绕构象时的温度。Inotersen类似物为20碱基对的DNA链，GC含量为40%。在各浓度下熔解温度均表现出优异的重现性，且浓度与Tm值之间存在显著正相关性——当浓度从1.4 mg/mL增加至72mg/mL时，熔解温度偏移超过7°C(图2A)。同样，eteplirsen类似物为30碱基对的互补DNA链，GC含量为43%。其熔解温度亦随浓度变化而变化，从1.4mg/mL时的76.79°C到72mg/mL时的81.70°C(图2B)。两种寡核苷酸三次重复实验的平均Tmax值及标准偏差见表1。
表1：20及30碱基对双链体浓度筛选的转变温度
平均值±标准差，n=3
配方缓冲液筛选
PCR经验表明，在引物选择中，随着阳离子盐浓度的增加，寡核苷酸的热稳定性会随之提高[9]。在通常情况下，盐浓度升高会导致寡核苷酸熔解温度(Tm)升高；但每个序列和结构都具有独特性，因此需要通过DSC进行进一步测试。当测试浓度为10、20和40mg/mL时，在磷酸盐缓冲液中添加75或150mM NaCl后，eteplirsen类似物的热稳定性得到增强(图3)。插图中的范特霍夫曲线清晰显示：未添加NaCl的样品，其浓度依赖性远高于75mM或150mM NaCl处理组。各样品条件下的平均熔解温度(Tm)与熔解起始温度(Tonset)详见表2。
图3：增加氯化钠浓度可提高30碱基对DNA双链体的热稳定性。
缓冲液成分：10mM磷酸钠，0-150mM氯化钠，pH 7.0。
数据以1°C/分钟的扫描速率进行三次实验测得。
表2：30碱基对双链体浓度筛选的
峰值转变温度(Tmax)和起始温度(Tonset)
平均值±标准差，n=4
etepliresen类似物的热稳定性不受pH值影响(图4和表3)，在整个pH值范围内均保持一致。
图4. 在pH值7.0-7.5范围内
30碱基对双链体熔解的热稳定性保持不变。
缓冲液成分：10mM磷酸钠，150mM氯化钠，pH 7.0-7.75。
数据以1℃/分钟的扫描速率进行三次实验测得。
表3：30碱基对双链体浓度筛选的
峰值转变温度(Tmax)和起始温度(Tonset)
平均值±标准差，n=4
结论
筛选溶液环境和序列修饰对短期热稳定性的影响对开发高质量的药用寡核苷酸至关重要。TA仪器RS-DSC可通过在制剂浓度下同时测试多达24个样本实现热稳定性的高通量筛选。本文展示了如何对双链体DNA寡核苷酸进行精确且可重复的分析，并快速测定缓冲液成分对整体热稳定性的影响，然后利用数据处理软件NanoAnalyze的新算法对高通量筛选中产生的大量热力学数据进行高效分析。总之，TA仪器RS-DSC为表征寡核苷酸的热稳定性提供了全新平台，为确保产品质量和支持注册备案提供了重要手段。
了解TA仪器快速筛选差示扫描量热仪(RS-DSC)的更多信息并获取相关应用指南，敬请点击此处或点击文末“阅读原文”与我们联系。
参考文献
1.
“Monitoring DNA Melting using Nano DSC,” TA Instruments, MC157.
2.
M. Gilar, S. Redstone and A. Gomes, “Impact of mobile and stationary phases on siRNA duplex stability in liquid chromatography,” J. Chromatogr. A, vol. 1733, p. 465285, 2024.
3.
L. Moumné, A.-C. Marie and N. Crouvezier, “Oligonucleotide Therapeutics: From Discovyer and Development to Patentability,” Pharmaceutics, vol. 14, p. 260, 2022.
4.
B. P. Vinjamuri, J. Pan and P. Peng, “A Review on Commercial Oligonucleotide Drug Products,” J. Pharm. Sci., vol. 113, pp. 1749-1768, 2024.
5.
M. Kuroda, Y. Kasahara, H. Yamaguma, M. Oda, C. Nagao and K. Mizuguchi, “Construction of a Tm-value prediction model and molecular dynamics study of AmNA-containing gapmer antisense oligonucleotide,” Molecular Therapy: Nucleic Acids, vol. 35, p. 102272, 2024.
6.
A. Aartsma-Rus and A. M. Krieg, “FDA Approves Eteplirsen for Duchenne Muscular Dystrophy: The Next Chapter in the Eteplirsen Saga,” Nucleic Acid Ther., vol. 27, pp. 1-3, 2017.
7.
D. Al Shaer, O. Al Musaimi, F. Albericio and B. G. de la Torre, “2018 FDA Tides Harvest,” Pharmaceuticals, vol. 12, p. 52, 2019.
8.
P. L. Privalov, Nucleic Acids. In. Microcalorimetry of Macromolecules, Hoboken, New Jersey: Wiley, 2012.
9.
Z.-J. Tan and S.-J. Chen, “Nucleic Acid Helix Stability: Effects of Salt Concentration, Cation Valence and Size, and Chain Length,” Biophys J, vol. 90, pp. 1175-1190, 2005.
致谢
本文由TA仪器的Christine S. Nervig博士、Viviana Costa博士和Samuel Redstone博士共同撰写，范洋晶校对。
TA Instruments和NanoAnalyze是沃特世公司的商标。EXONDYS 51是Sarepta Therapeutics, Inc的商标。TEGSEDI是Akcea Therapeutics, Inc的商标。NanoDrop是NanoDrop Technologies LLC的商标。Gibco是Life Technologies Corporation的商标。
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