【Zeno SWATH DIA】ZenoTOF 7600联用Evosep One之高通量定量蛋白质组学研究方案

鉴定和定量大量蛋白质和肽段对于了解生物功能具有重要意义，如通过大队列研究来筛选疾病生物标志物。由于体液、组织、细胞等生物样品的复杂性，数据依赖性采集（DDA）技术具有随机性，因此在进行蛋白质鉴定和定量时具有局限性。而数据非依赖性采集（DIA或者SWATH DIA）技术可以克服这一局限，尤其是Zeno SWATH DIA可使二级质谱灵敏度提高5-6倍左右，在进行复杂基质的蛋白质鉴定和定量时效果要优于DDA技术，这一优势在目前的短梯度、高通量蛋白质组学研究中表现得尤为突出。

为了满足高通量蛋白质组学研究需求，Evosep One系统（Evosep）提供了带有预设方法的标准化的液相，并舍弃了捕集柱，这一系统经过优化使得用户可以根据每天运行的样品数目（Sample Per Day, SPD）来选择合适的柱子、流速和运行时间，具有很好的重现性和稳定性，可以提高质谱的采集效率。我们使用ZenoTOF 7600系统连接Evosep One液相，应用Zeno SWATH DIA流程，进行高通量蛋白质组学研究，考察蛋白质鉴定和定量结果。

样本准备：HeLa细胞酶解产物。

液相方法：使用Evosep One 系统 （Evosep, Denmark）的预设方法，A相：水，0.1%甲酸，B相：乙腈，0.1%甲酸。

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质谱方法：ZenoTOF 7600系统，采集模式：Zeno SWATH DIA，其中200 SPD、100 SPD 和 60 SPD方法使用微升流速，30 SPD方法使用纳升流速。

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数据分析：Zeno SWATH DIA数据使用DIA- NN 1.8.1[1]软件处理，分别使用人细胞样品高pH反相分级Zeno DDA建库的数据库 （ZT Lib）、人的FASTA文件蛋白质序列理论库（in silico library，Lib Free，不建库）或者Pan Human数据库[2]（PHL）进行数据分析。

主要结果： 

1.

可以根据通量和覆盖深度的

要求选择不同的液相方法

随着样品进样量的增加，蛋白质鉴定和定量数随之增加。Hela样品在50ng较低进样量时，鉴定到的蛋白质中仍有高达70%以上都可以被定量，其中30 SPD的通量可以鉴定到5727个蛋白质（FDR<1%），定量到4232个蛋白质（CV<20%）。200ng进样量时，鉴定到的蛋白质90%左右都可以被定量，其中30 SPD的通量可以鉴定到7014个蛋白质（FDR<1%），定量CV<20%蛋白质6189个（图1）。

随着运行时间的增加，通量会降低，蛋白质组覆盖的深度增加，这与预期结果一致。当通量从200 SPD降到30 SPD时，对于50ng和200ng进样量，蛋白质鉴定数分别增加了102%和82%，蛋白质定量数分别增加了77%和80%。采用100 SPD的方法，进样200ng，仍然可以鉴定到5499个蛋白质，定量到4870个蛋白质，同时达到高通量和高覆盖深度。

图1. 进样量200ng（左图）和50ng（右图）

时不同液相条件下（SPD）蛋白质的鉴定和定量数目

图中透明条带代表FDR<1%时蛋白质鉴定数，实心条带代表FDR <1%和CV <20%的蛋白质定量数，上方橙色线代表蛋白质定量数占鉴定数的百分比。

2.

不同数据库分析结果的比较

使用DIA-NN软件进行数据处理，200ng进样量，分别用Lib Free 、PHL 和ZT Lib三种数据库进行分析，可以看到，使用谱图库和无谱图库蛋白质鉴定数和定量数基本一致（图2）。比较Lib Free（不建库）和ZT Lib（建库）的定量结果，二者有90%的蛋白质是一样的。

Zeno SWATH DIA在获得蛋白质鉴定结果的同时也可以获得定量结果，而使用library-free即不建库的方式进行搜索是一种很有效的数据处理模式，因其可省去建库的步骤。

图2. 200ng进样量 不同数据库分析结果的比较

上图：不同通量下三种数据库的鉴定和定量结果

下图：30 SPD条件下，使用Lib Free 和ZT Lib的定量结果（FDR <1%，CV <20%）

3.

不同进样量、通量条件下，

肽段定量结果比较

随后比较了不同进样量和通量条件下定量到的肽段数，当200ng进样量，200 SPD的通量可以定量到15000条肽段；30 SPD的通量可以定量到42000条肽段。当通量从100 SPD降低到60 SPD时，鉴定水平显著提升（增加43%）。60 SPD通量可平衡鉴定和定量。综合考虑通量和不同进样量的情况下，低进样量更有利于高通量分析（图3）。

图3. 不同进样量和通量条件下定量到的肽段数

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ZenoTOF 7600系统由于具有Zeno trap功能，可以大幅提高二级质谱灵敏度，使用Zeno SWATH DIA采集技术可以实现更深的蛋白质覆盖度和定量重现性，与Evosep One系统结合，在蛋白质组学研究中可实现更高的通量和稳定性。

文献：

[1] Demichev V et al. (2019) DIA-NN: neural networks and interference correction enable deep proteome coverage in high throughput. Nature Methods, 17, 41-44.

[2] Rosenberger G et al (2014) A repository of assays to quantify 10,000 human proteins by SWATH-MS. Scientific data. 1, 140031. 

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