使用DS3000 进行细胞鉴定的实例

概要

细胞株的误识别或污染，将对实验结果有很大的影响。因此，推荐定期实施细胞株鉴定(Cell Line Authentication: CLA)，并确认无外来细胞的混入或置换。在CLA中，广泛使用对STR(Short Tandem Repeat)进行分析的方法。STR是散布在基因组中的以2-7个碱基短串联重复序列。不同个体间的STR的重复次数（等位基因）各不相同，因此STR是DNA鉴定中很有用的标记。在CLA中首先用PCR扩增多个STR后，通过毛细管电泳鉴定每个等位基因。然后，将已鉴定的等位基因与在ATCC(American Type Culture Collection)等生物资源中心注册的各个的等位基因（以下，标记为参考等位基因）相比较而鉴定细胞株（1）。此时，为了获取高可靠性的结果，仪器需要具有高分析性能。

在此，介绍使用DS3000 Compact CE Sequencer (以下简称DS3000)时的CLA实例。用GenePrint® 10 System与GenePrint® 24 System (Promega®)验证的结果，以DS3000获取的等位基因与参考等位基因的一致程度为大于等于80%时，将其判断为相同细胞（2）。由此可知，DS3000具有可进行CLA的分析性能。

结果

检测单细胞基因组DNA

按照GenePrint ® 10 System及GenePrint ® 24 System的程序，用PCR扩增了5种人细胞基因组DNA (HeLa, Jurkat, MCF7, K562,2800M DNA)的STR区域。然后，用DS3000对获取的PCR扩增子进行了电泳分析。分析中所用的电泳数据为GeneMarker　HID(ver.2.9.0)及GeneMapper ID-X (ver.1.6)。

图1为用GenePrint ® 10 System时获取的波形数据示例，图２是用GenePrint ® 24 System获取的波形数据示例。从图可以看出，检测到预期的基因型峰值。表1、2对以各个细胞株鉴定的等位基因以及参考等位基因进行了总结。并且确认到用5种人细胞基因组DNA鉴定的等位基因与参考等位基因的一致程度大于等于80% 。用GenePrint ® 24 System时也得出了相同的结果。另外，用Masters式子（相一致的已鉴定等位基因与参考等位基因数/所鉴定等位基因总数）算出了相一致等位基因的百分比(2)。

图1: GenePrint® 10 System的波形数据

表示Allelic ladder (A)与2800 M DNA (B)的结果。X轴表示碱基长度（bp），Y轴表示信号强度（RFU）。

检测混合样品

在此确认将两种基因组DNA以各种比率混合后，能否检测出样品的污染。首先，用以下比率(MCF7的比率：0、1、2、3、4、5、10、30、100％)混合了Jurkat的基因组ＤＮＡ与MCF7的基因组。用GenePrint ® 10 System及GenePrint ® 24 System扩增了这些样品的STR区域。然后，使用DS3000进行STR分析。图3表示GenePrint ® 10 System的D13S317标记上的波形数据的一个示例。

可以确认出Jurkat固有等位基因8与12。当混合了MCF7时，检测到等位基因11，而随着MCF7的量比增多，荧光强度也将增大。图4总结了样品中的MCF7比率与对Jurkat的参考等位基因的一致率。从图中可以看出，混合了3%的MCF7时，Jurkat固有的等位基因与参考等位基因的一致率小于80%。由此可知，在Jurkat细胞种混合了至少3%MCF7细胞时，可以用DS3000检查出混合状况。

用Masters式子（相一致的已鉴定等位基因与参考等位基因数/所鉴定等位基因总数）（2）算出了一致率。

图2:GenePrint® 24 System的波形数据

表示Allelic ladder (A)与2800 M DNA (B)的结果。X轴表示碱基长度（bp），Y轴表示信号强度（RFU）。

结论

本报告中验证了可否用DS3000进行CLA。用5种单细胞基因组DNA实施了STR分析的结果，在所有分析中确认到了所鉴定等位基因与参考等位基因的一致率大于等于80%。

并且，使用将MCF7与Jurkat细胞株基因组DNA以各种混合率混合的样品进行了检测。结果，确认到混合细胞的百分比至少为3%时，可以用DS3000检测出来。

由此可知，使用此次所用的胞株基因组DNA及STR试剂时，DS3000充分满足CLA所需的性能。

实验

从BioChain Institute Inc. 购买了HeLa、Jurkat、MCF7的基因组。从Promega ® 购买了K562と2800M DNA。

按照各个套件所附带的程序，进行了STR扩增。PCR中使用了5 ng（GenePrint ®10 System）或2.5 ng（GenePrint ® 24 System）的DNA。按照表3所记载的程序进行了电泳。用GeneMarker HID (ver. 2.9.0、SoftGenetics)及GeneMapper ID-X（ver. 1.6、Applied　BiosystemsTM）进行了波形数据的绘制与长度识别、等位基因识别。

从ATCC 获取了HeLa、Jurkat、MCF7、K562的参考等位基因。从Promega ® 获取了2800M DNA的参考等位基因。

图3：Jurkat与MCF7的混合DNA的波形数据示例

表示对于MCF7固有的等位基因（D13S317: 11），各种DNA量比上的信号强度的变化。

数值表示样品中的MCF7比率。X轴表示碱基长度（bp），Y轴表示信号强度（RFU）。

图4：表示Jurkat与MCF7的混合DNA上的Jurkat等位基因与参考等位基因的一致率。

水平数轴表示样品中的MCF7比率。

仅限科研使用，不可用于医疗诊断及其相关用途。

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・BigDye是Thermo Fisher Scientific Inc.的商标。

・PowerPlex 是Promega Corporation的商标。

・Promega 是Promega Corporation的商标。

・本资料中刊登的数据仅为测试示例，不确保数据的准确性。

参考文献

(1) American Type Culture Collection, Authentication of Human Cell Lines: Standardization of STR Profiling. ANSI/ATCC ASN-0002-2011.

(2) Capes-Davis, A., et al. Match criteria for human cell line authentication: Where do we draw the line? Int. J. Cancer 132, 2510–2519 (2013)