高通量核酸定量?标准答案送上,来抄!
实验室常用的核酸检测方法有A260/A280吸收光检测法和荧光检测法。其中吸收光检测法主要用于核酸纯度检测和浓度检测,但是受限于吸收光方法学的局限性,浓度检测准确度和灵敏度相比荧光方法要低。
荧光检测法使用的荧光染料能够特异地与核酸分子相结合,在特定波长光源的激发下发出荧光,核酸浓度在一定范围内与荧光强度成正比,可有效区分出双链 DNA 、单链 DNA 和 RNA ,同时不受游离核苷酸、蛋白、盐离子和其他杂质的干扰。此外,与核酸结合的染料相较其游离态荧光信号增强数十倍至数百倍,使检测结果可以获得更高的信噪比。
因此,对于一些需要精确测定低浓度样本的实验,荧光染料法是不可或缺的,例如基因芯片、测序文库构建等。在新一代测序实验中,核酸样品的准确定量对核酸的片段化效果有直接的影响,例如在使用酶切方法时,过高的核酸浓度使得酶切不完全,导致文库中大片段偏多;而过低的核酸浓度容易导致酶切过度,造成小片段增多。
传统的荧光染料法使用微量离心管检测,通量低且检测时间长,满足难以满足大基数样本的快速定量。采用 96 孔微孔板结合酶标仪进行荧光染料法核酸定量,既能满足低浓度样本精确定量的需求,又实现了高通量检测的目的。 安捷伦BioTek Synergy 系列多功能酶标仪产品,已在该方向上为许多实验者解决了燃眉之急。
下面笔者将以 Qubit® dsDNA BR Assay Kit 在 Synergy Neo2 上的应用为例,为大家介绍使用 Synergy 系列多功能微孔板检测仪制作标准曲线并测定 DNA 浓度的方法。
材料:
Qubit® dsDNA BR Assay Kit (Invitrogen,# Q32850)
纯化的鲱鱼精子 DNA (Sigma-Aldrich, # D6898),于 TE 缓冲液中保存
TE 缓冲液 (10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8.0).
96 孔黑色平底聚苯乙烯微孔板(Corning, #3915)
量程为 10 -200μL 的移液器
GFP 滤光片 Cube(PN 1035108 EX 485/20 EM 530/25,DM 510)
方法:
用缓冲液将 200× 浓缩液稀释 200 倍。
为适配试剂本身的分析范围,将 TE 缓冲液中的 2.2 mg/mL 鲱鱼精子 DNA 溶液梯度稀释成 4 个梯度:0.1 、1 、10 和1000 ng/µL 。
用移液器将样品和 10 µL DNA 标准品添加到 96 孔板中,然后添加适量的工作液使最 终体积为 200µL ,室温孵育 5 分钟后上机检测。
程序设定:
1. 在孔板类型下拉菜单中选择“96-well plate”
2. 在检测方法界面依次选择“荧光强度”-“终点/动力学”-“滤光片”
3. 在检测步骤界面设置好标签,选择单 PMT 顶部检测,下拉选择“485/528”滤光片组,增益设置为 50
板布局:
设置标准品、本底和样品位置,并根据配置的标准品浓度进行标注
数据处理:
1. 本底扣除
2. 标准品曲线设置:将 X 轴设置为浓度,Y 轴为扣除本底的 528nm 处荧光值,曲线拟合选择四参数非线性回归,并将轴演示都设置为对数
结果:
在 Gen5™ 中绘制四参数非线性拟合的标准曲线,显示相关性良好
上述实验表明,Synergy Neo2 可以提供有效的高通量核酸荧光定量方法。详情请点击文末阅读原文参考 Qubit Assay using Synergy Neo2
除此之外,Synergy 系列多功能微孔板检测仪提供三种震板模式和恒温孵育功能,实验者可预先设置程序,在完成加样后直接将 96 孔板放入检测仪中进行混匀和避光孵育,无需繁复操作,直接检测。Synergy Neo2 在检测速度和灵敏度上具有无可比拟的巨大优势:可以在 6 秒内完成 96 孔板的荧光强度检测;当使用 384 孔板检测时,顶部检测模块荧光检测灵敏度高达 0.2 pM 。
荧光染料法可以测定单种核酸的浓度却无法鉴定样品纯度,但在实际操作中,样品的纯度也是保证实验结果可靠的重要因素。核酸纯度通常由紫外分光光度法得到,主要以核酸在 260nm 和 280nm 处吸光度的比值衡量。
Synergy 系列多功能微孔板检测仪不仅支持荧光强度的检测,还提供全波长吸收光检测和发光检测。搭配 Take3 或 Take3 Trio 微量核酸浓度检测板和 Gen5™ 预设程序,可在一次运行中测定 16 或 48 个样品,实现高通量紫外吸收光核酸定量,大大提高检测效率。拥有一台仪器即可完成高质量微量核酸浓度和纯度测定,为核酸浓度测定提供真正的高通量解决方案。
高通量解决方案
Agilent BioTek 的 Synergy 系列多功能微孔板检测仪,可实现全波长吸收光、荧光和化学发光检测。独特的 Hybrid 技术可为多种应用提供出色的灵敏度和灵活性:四光栅系统支持全波长荧光检测,波长灵活选择,带宽连续可调(Synergy H1 为 9 ~ 50 nm,Synergy Neo2 为 3 ~ 50 nm ),能够更好地兼顾荧光探针的特异性和灵敏度;滤光片系统搭载灵敏的高透射滤光片,支持均相时间分辨荧光(HTRF)、荧光偏振(FP)等高级荧光检测。二者光路独立,可确保在所有检测模式下具有出色的性能。
BioTek Synergy Neo2 应用范围极广,适用于各类药物筛选、分子相互作用、细胞代谢、细胞因子检测等方向,涵盖细胞、分子、药物等多个领域的实验需求。此外,Synergy Neo2 可装配用于 ALPHA 和 TRF 检测的激光器,有效提高灵敏度和读取速度。4 个 PMT 提供超快测量速度,顶部双 PMT 模块可同时进行两次测量,能同时采集两个发射信号,有效地将测量速度提高一倍,可以一次性获得 FP 、FRET 和 TR-FRET 测量结果,节省实验时间。同时,四区温控技术提供稳定温度控制,外接气控模块控制舱内 O2 与 CO2 浓度,为活细胞的长期检测提供了适宜的环境条件。
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