捕捉神经递质受体和离子通道

利用高分辨率显微技术确定膜蛋白的位置

zhong shu神经系统中的神经递质受体和离子通道位于神经元突触前后的膜室和突触外膜室内。这些蛋白质的激活对突触融合和调节递质释放的影响取决于它们相对于突触的精确位置，以及分子在细胞微隔室的密度大小和耦合效应。因此，对膜约束受体和离子通道进行高分辨率的定性与定量的可视化研究，对于理解它们在细胞通讯中发挥的作用至关重要。

神经网络中的分子动力学

神经系统的学习能力和环境适应能力表明，从动力学角度而言，神经元具有改变其连接数量、类型和强度的基本能力。这些连接被称为突触，是突触后神经元和突触前末梢之间高度有序的接点。特化的突触膜包含大量分子，如受体、离子通道和相关结构蛋白，其中精确的亚细胞结构对其发挥正常功能具有促进作用。大量研究表明，这些蛋白质的位置和它们相对于突触的位置都会对其功能作用产生实质性影响。神经递质受体位于神经元突触后区的突触膜上，直接接触释放的神经递质。

因此，受体瞬时激活，迅速产生突触后反应，与突触前动作电位之间具有精确的锁时关系。相反，位于突触外质膜上的受体，远离突触点，被溢出的神经递质激活，产生抑制性电导，该电导与单个突触前动作电位之间并不存在精确的锁时关系，而是以较慢的速度反映整体网络活动[1]。受体也可位于突触前，要么位于轴突末梢的突触外膜上，要么位于突触前网格上，由相同或相邻的突触扣结释放出的神经递质所激活。与神经递质受体一样，离子通道也位于神经元的树突膜和轴突末梢上。突触后通道通常在突触输入的融合与可塑性方面发挥作用，并通过介导缓慢的抑制性突触反应，增强静息膜电位，来控制神经元兴奋。

集中于突触前活性区或位于突触扣结外膜的突触前离子通道参与调节神经递质的释放，从而在神经元活动的突触前调节中发挥作用。因此，很容易理解，同一受体和离子通道针对细胞的不同亚细胞区室时可以满足不同的功能要求 [1]。

此外，膜蛋白激活对突触融合与调节递质释放所产生的影响，主要取决于受体和离子通道在靶神经元区室的密度大小和功能耦合，膜蛋白激活对受体和离子通道相对于兴奋性和抑制性突触点所处位置的影响也是同理。因此，问题在于如何在高分辨率下精准确定这些分子的亚细胞位置。

先进的高分辨率免疫细胞化学方法

为此，下列先进的高分辨率免疫细胞化学方法已得到广泛应用：

1,包埋前免疫胶体金法；

2,包埋后免疫胶体金法；

3,基于十二烷基硫酸钠(SDS)的冷冻断裂复型标记(SDS-FRL)技术。

（1）在包埋前免疫胶体金法中，一个0.8nm或1.4nm的金颗粒与二抗发生耦合反应，从而促进适当的渗透。随后采用银强化法，对金颗粒进行强化，生成大小足以被检测的颗粒。

由于这种方法生成了非扩散性标记，因此可以确定发生反应的精确位置以及蛋白质在突触外和突触周围所处的位置。然而，我们无法利用这种方法检测突触蛋白，原因可能在于固定组织的特化突触结构中的抗原表位难以确定[2]。

（2）包埋后免疫胶体金法解决了包埋前技术存在的问题。该方法使免疫化学品与暴露在超薄切片表面的抗原发生反应，随后采用与检测非突触分子相同的灵敏性检测法来检测突触蛋白。这种方法还改善了蛋白质密度的定量评估。

但是，在树脂包埋切片中，大量蛋白质掩藏，无法确定抗体，如此便限制了这种技术的检测灵敏度[2]。

（3）在SDS-FRL技术中，我们先用高压冷冻仪（徕卡EM ICE）对脑组织进行冷冻，然后使用复型仪（徕卡EM ACE900）对冷冻样本进行冷冻断裂。蛋白质会被分配到质膜的原生质面（P面）或外质面（E面）。将分子固定在薄碳层（3-5nm）上，再进行2nm厚的铂/碳层镀膜，遮住膜面，然后用15-20nm厚的碳沉积物强化这种材料[3]。与传统的免疫胶体金法相比，SDS-FRL技术有两个主要优势。

首先，SDS-FRL技术的灵敏度大大高于包埋前和包埋后技术，因为膜蛋白暴露于复型品的二维表面（图1），使其很容易接触到免疫试剂。此外，SDS会使抗原表位发生变性，让适合进行免疫印迹解析的抗体与固定在复型膜上的蛋白质发生相似反应。其次，我们可以同时观察到突触蛋白质和突触外蛋白质，并且可以在膜段中实现免疫胶体金密度的量化。

图1：利用SDS冷冻断裂复型标记技术展示海马细胞树突中GABA（B1）和Kir3.2的分布和共定位分析。图A：在一个假定锥体细胞的树突轴（Den）和树突棘（s）的表面上发现了GABA(B1)亚单位的免疫颗粒群（箭头处）。图B、C：Kir3.2（5nm颗粒；双箭头处）、GABA（B1）（10nm；箭头处）和PSD-95（C中15nm）的双重和三重免疫胶体金标记显示，这两种蛋白质在锥体细胞的树突棘（B和C）中聚集，并与PSD-95（C）的免疫反应所指的谷氨酸能突触相关联。比例尺:200 nm

与其他方法一样，这种免疫细胞化学法也有一定局限性。首先，我们很难识别标记的形态结构，因此，有必要使用标记蛋白，从而有助于识别经过断裂的膜[6]。其次，我们无法预测膜蛋白会分离到P面还是E面：有些蛋白优先分到P面，如GABA（B1）、Kir3.2[4]，或分到E面，如AMPA受体[5]，而其他蛋白，如gluRδ2[6]，则同时定位于两个面。因此，进行定量研究应仔细检查分子的分配。

综上所述，这三种免疫细胞化学技术提供了关于蛋白质的细胞和亚细胞分布的补充信息，在高分辨率下对受体和离子通道在神经元突触前后区的定位和共定位问题进行定性定量分析时，这些技术得到广泛应用。

参考文献

1. Farrant M, Nusser Z: Variations on an inhibitory theme: phasic and tonic activation of GABA(A) receptors. Nature Rev Neuroscience 6:3 (2005) 215–229.

2. Lujan R, Nusser Z, Roberts JDB, Shigemoto R, Somogyi P: Perisynaptic location of metabotropic glutamate receptors mGluR1 and mGluR5 on dendrites and dendritic spines in the rat hippocampus. Eur J Neuroscience 8:7 (1996) 1488–1500.

3. Fukazawa Y, Masugi-Tokita M, Tarusawa E, Hagiwara H, Shigemoto R: SDS-digested freezefracture replica labeling (SDS-FRL), in: Handbook of Cryo-preparation Methods for Electron microscopy, eds. Cavalier A, Spehner D, Humbel BM; CRC Press, New York (2009) 567–586.

4. Kulik A, Vida I, Fukazawa Y, Guetg N, Kasugai Y, Marker CL, Rigato F, Bettler B, Wickman K, Frotscher M, Shigemoto R. Compartment-dependent colocalization of Kir3.2-containing K+ channels and GABAB receptors in hippocampal pyramidal cells. J Neuroscience 26:16 (2006) 4289–4297.

5. Masugi-Tokita M, Tarusawa E, Watanabe M, Molnar E, Fujimoto K, Shigemoto R: Number and density of AMPA receptors in individual synapses in the rat cerebellum as revealed by SDS-digested freeze-fracture replica labeling. J Neuroscience 27:8 (2007a) 2135–2144.

6. Masugi-Tokita M, Shigemoto R: High-resolution quantitative visualization of glutamate and GABA receptors at central synapses. Curr opinion in Neurobiology 17 (2007b) 387–393.

7.Fujimoto K: Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Journal of Cell Science 108 (1995) 3443–3449.