人人都是流式高手：如何发现流式配色中的错误

流式细胞术中的配色是非常重要的，因为它直接影响到对细胞亚群的准确鉴定和定量分析。使用流式细胞术进行免疫分型，不同的细胞亚群在表型和功能上可能存在差异。通过合理的配色设计，可以选择具有特定表面标记物的抗体，从而区分和鉴定不同的细胞亚群。准确的配色可以帮助我们了解细胞群体的复杂性，并识别和研究不同亚群的特征和功能。

如果配色不合理又会怎样呢？

请看下面两组配色，使用的免疫标志物都是一样的，只是在荧光素的搭配上不一样。

接下来我们看两组配色的结果

可以看出从配色的结果，CD25的表达两个配色结果接近，但是第1组配色中，CD69阳性的细胞很难检出。不合理的配色会导致出现假阴性信号，这里我们就从这个例子出发，看如何一步一步的发现配色中的问题所在，并且纠正。

在寻找配色错误搭配之前，要知道是什么导致了不同配色产生了这种差异。

造成这种原因其实就是我们平时说到spreading现象。

Nguyen, Richard, et al. "Quantifying spillover spreading for comparing instrument performance and aiding in multicolor panel design." Cytometry Part A 83.3 (2013): 306-315.

由于spreading现象，所以在共表达检测中会产生一个信号交叠的区域，我们称为“灰区”。

虽然FMO（Fluorescence-Minus-One）控制方法可以防止潜在的背景事件被错误地分类为阳性，但它忽视了由背景群体的上限和低表达阳性群体的下限所构成的“灰区”。这个“灰区”包含了无法区分的阴性和低表达阳性事件。

那么我们如何发现并且避免呢？我们可以使用“switch-off” (SWOFF)模型进行判断。

我们可以充分利用FMO样本，对通道进行检查，为了便于观察，我们可以将FMO样本与完全染色叠加，去验证spreading的干扰程度。并且判断是否需要优化。

我们结合具体实验进行讲解。

两组不同的配色，我们使用SWOFF模型来寻找问题出在哪里。通过对比关键散点图中全染与FMO的散点图叠加。

允许在配色验证过程中早期排除效果不佳的组合。尽管CD45-ECD（panel 3）标记了所有的白细胞，并且在左图中通过溢出扩散实际上掩盖了CD4+CD127hiCD117+亚群，但T细胞缺失的CD19-ECD（panel 4）并不影响CD4+CD127+CD117+的检测，右图所示。

在右图中，SWOFF分析揭示了尽管CD8-APC-A700+在Panel 4中对APC探测器产生了较强的扩散影响，但对双峰式的CD4-APC的检测没有影响。左图显示了panel 3在APC通道中较低的溢出扩散，但实际上这并没有优于panel 4。

揭示了成熟T细胞上CD4与CD8的排他性表达特征，使得门控策略能够规避与溢出扩散相关的群体分离的影响。

SWOFF分析是一种经济且信息丰富的工具，可以验证抗体偶联物的选择，并揭示数据解释的潜力。

一方面，FMO可以作为很好的对照，区分阴性与阳性信号，另一方面，由于某些抗体配色破坏了对其共表达的低表达抗原目标群体的门控策略。FMO也可以轻松识别出方案是否对于低表达抗原检测的灵敏度低。即使基于纯粹的散射门控也可以进行SWOFF分析。

即便使用荧光通道与散射光信号，使用SWOFF模型也能很好地评估Spreading的影响。

需要注意的是，对于具有双峰表达特征的群体门控标记物（例如CD3等），不需要使用FMO进行划门，因此往往会被省略。相反，在SWOFF模式下分析结果时，排除强标记物的意义非常重要，因为它们对其他探测器上的溢出扩散的贡献可能很大，这表明FMO控制方法应包括所有标记物。

如果大家想降低spreading，就需要借助科技的力量啦。CytoFLEX系列流式细胞仪采用APD检测器，相较于以前的PMT检测器拥有更高的灵敏度，并且更小的spreading现象。这使得配色也更加的轻松，结果也更加的准确。

在流式分析时让您能够轻松获得更加精 准的结果，在流式分选时也不遗漏您珍贵的弱阳性细胞。