中检院合作文章——高分辨质谱对AAV2衣壳蛋白表征分析

腺相关病毒 (Adeno-associated virus，AAV) 因其低免疫原性、低基因毒性、在多种不同组织类型具有持久基因表达、作用时间长以及易于生产等特性，成为了临床基因治 疗领域广泛应用的基因治 疗载体[1]。AAV病毒属于细小病毒家族，无包膜，由衣壳蛋白和单链DNA（全长4.7kb）组成。不同血清型的AAV均由三种不同的衣壳病毒蛋白（VP：VP1（～80 kDa），VP2（～65 kDa）和VP3（～60 kDa））按照摩尔比约1:1:10组装成二十面体结构[2]。衣壳蛋白除保护病毒基因组外，在介导受体结合、病毒逃逸，将病毒DNA运送至靶标细胞中发挥重要作用。衣壳蛋白序列或者翻译后修饰的改变，均可影响病毒载体的靶向性和感染性[3]。

因此，确保AAV药物应用于人基因治 疗的有效性和安全性，对AAV载体质量属性进行监控具有重要意义。相较于治 疗性蛋白，大多数AAV样本蛋白质浓度低（0.01-0.1mg/mL），可用于分析的样本量有限，给AAV表征分析带来巨大挑战[4]。微流速液相色谱串联质谱（Microflow LC/MS-MS）系统以其高通量、稳定的分析性能，兼具良好的灵敏度等特点，被广泛的应用于蛋白质组学、生物制品表征分析[5]。

本研究中，SCIEX合作中国食品药品检定研究院重组室，应用微升流速液相色谱串联质谱技术（Microflow LC-MS/MS）对低浓度的AAV2衣壳蛋白（8×1011 GC/mL）进行表征分析，发表在期刊《Applied Biochemistry and Biotechnology》上。通过数据依赖型采集（Information dependent acquisition，IDA）技术进行肽图分析，实现了对AAV2衣壳蛋白将近100%的序列覆盖度，同时获得超过30个翻译后修饰位点鉴定和相对定量信息。通过碰撞诱导解离（CID）技术，获得高质量二级质谱数据实现氨基酸序列完整匹配，以及应用电子活化解离EAD技术实现氨基酸同分异构体区分。微升流速液相色谱（Microflow LC）系统联合ZenoTOF® 7600 系统在实现高通量、稳定分析的同时，兼具良好灵敏度，为大批量、低浓度生物制品样本表征分析提供技术支撑。

结果与分析

AAV2衣壳蛋白序列覆盖度分析

ZenoTOF® 7600 系统，Zeno™ trap，将占空比提高到大于90%，减少离子损失，实现更高的MS/MS灵敏度。结合具有稳定、高通量，同时兼具良好灵敏度的微升流速液相色谱系统对低样本量的AAV2样本进行分离，在提升分析灵敏度的同时，获得高质量的二级谱图。通过数据库的匹配分析，AAV2衣壳蛋白序列覆盖度将近100%（图1）。其中通过二级质谱数据匹配的序列达95%，通过一级质谱数据匹配的序列为5%。

图1.  AAV2衣壳蛋白序列覆盖度图谱。

AAV2衣壳蛋白翻译后修饰分析

Biologics Explorer™ 软件通过预建立的分析流程，在数据库匹配分析模块设置翻译后修饰类型，实现翻译后修饰位点快速、流程化鉴定和定量分析。应用Biologics Explorer™ 软件分析，在AAV2衣壳蛋白中共鉴定到32个修饰位点（表1），修饰类型包括脱酰胺、氧化、乙酰化修饰。其中相对丰度 >1%的PTMs有20个。相对丰度 <1%的PTMs有11个，如N317、Q319、Q464的脱酰胺修饰，A2和L315乙酰化修饰。

应用高灵敏度的微升流速液相色谱系统和Zeno™ trap技术，在实现对低丰度翻译后修饰肽段分析的同时，获得肽段高质量的二级质谱图，实现肽段序列完整匹配。图2分别展示了在第464位和第614位的谷酰氨（Q）发生脱酰胺修饰肽段LQFSQAGASDIR（图2A）和DVYLQGPIWAK（图2B）的Native和脱酰胺修饰两种形式的提取离子色谱图。两条肽段脱酰胺修饰形式的相对丰度均很低，其相对丰度分别仅为0.07% (LQFSQAGASDIR) 和0.38% (DVYLQGPIWAK) 。

表1. AAV2衣壳蛋白鉴定到的翻译后修饰列表

图2. 肽段Native和Deamidated形式提取离子流色谱图。

A. 肽段LQFSQAGASDIR；B.肽段BDVYLQGPIWAK

蛋白质脱酰胺化是天冬酰胺残基侧链发生脱酰胺反应形成天冬氨酸（Asp）或异天冬氨酸（isoAsp）。AAV载体的脱酰胺化可影响衣壳蛋白组装和转导效率，以及影响其组织趋向性和衣壳蛋白与免疫系统的互作[6]。碰撞诱导解离（CID）碎裂是常用的质谱碎裂技术，能够提供氨基酸序列确认。然而，其在区分同分异构体，如Asp和isoAsp具有较大挑战。而电子活化解离（EAD）技术可产生特征性的诊断碎片离子，实现氨基酸异构体的区分[7]。肽段YLGPFNGLDK存在三种脱酰胺修饰形式，EAD二级图谱展示（图3B、D），通过诊断离子z5-57确定肽段YLGPFNGLDK在保留时间22.3min和24.8min对应为isoAsp形式。诊断离子z5-44确证保留时间23.1min对应为Asp形式（图3C）。据文献报道，两种isoAsp形式，L-isoAsp形式丰度相对更高[8,9]。

图3. EAD碎裂模式下，肽段YLGPFNGLDK三种脱酰胺修饰形式XIC图谱（A）及通过EAD碎裂产生的诊断离子确定为Asp或isoAsp（B-D）。通过z5-57诊断离子(绿色标注) 确证为isoAsp (B、D)，通过z-44诊断离子确证为Asp (C) 。

小结

1.微升流速液相色谱系统具有稳定、高通量，兼具良好灵敏度的特性，应用微升流速液相色谱系统联合ZenoTOF® 7600 系统实现了对低样本量AAV2衣壳蛋白将近100%氨基酸序列覆盖分析。

2,Zeno™ trap 技术显著提高二级质谱灵敏度，结合CID采集技术获得高质量二级质谱数据，实现氨基酸序列高可信度的完整匹配。

3.EAD碎裂技术提供翻译后修饰位点准确定位，以及区分氨基酸同分异构体，为生物制品深度、精 准表征分析提供技术支撑。

4.Biologics Explorer™ 软件提供便捷、流程化的分析工具，实现包括完整分子量、肽图分析、翻译后修饰位点鉴定及相对定量快速、自动化分析。

参考文献

[1] Leszek Lisowski., Szun Szun Tay., & Ian Edward Alexander. Adeno-associated virus serotypes for gene therapeutics. Current Opinion in Pharmacology. 2016. 24, 59–67.

[2] R.J. Samulski, N. Muzyczka. AAV-mediated gene therapy for research and therapeutic purposes. Annual Review of Virology. 2014.1: 427–451.

[3] Jin X, Liu L, Nass S, et al. Direct Liquid Chromatography/Mass Spectrometry Analysis for Complete Characterization of Recombinant Adeno-Associated Virus Capsid Proteins. Human Gene Therapy Methods. 2017. 28(5):255-267.

[4] Guapo F, Strasser L, S Millán-Martín, et al. Fast and efficient digestion of adeno associated virus (AAV) capsid proteins for liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) based peptide mapping and post translational modification analysis (PTMs). Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 2022. 207:114427.

[5] Vowinckel J, Zelezniak A, Bruderer R, et al. Cost-effective generation of precise label-free quantitative proteomes in high-throughput by microLC and data-independent acquisition. Scientific Report. 2018, 8(1):4346.

[6] April R, Giles, Joshua J, et al. Deamidation of Amino Acids on the Surface of Adeno-Associated Virus Capsids Leads to Charge Heterogeneity and Altered Vector Function[J]. Molecular therapy.2018. 26(12): 2848–2862.

[7] Differentiation of aspartic and isoaspartic acid using electron activated dissociation (EAD). SCIEX technical note RUO-MKT-02-12550-B.

[8] Comparative analysis of intact AAV8 capsid proteins derived from SF9 and HEK293 cell lines. SCIEX technical note RUO-MKT-02-12917-A.

[9] Marine Morvan and Ivan Miksik. Recent advances in chiral analysis of proteins and peptides. Separations. 2021. 8(8): 112.