纳米抗体制备流程详解

1.什么是纳米抗体

纳米抗体是由比利时科学家于1993年在自然杂志中S次报道。传统抗体分子(IgG)是由两条相同的重链和两条相同的轻链组成的结构比较保守的抗体分子。抗体分子的轻链包含1个VL区和1个CL区，而重链则拥有1个VH区和3个CH区(CH1、CH2和CH3)。

羊驼只有重链抗体缺少轻链，由4个HC和2个VH组成，其中VHH区域又被称为纳米抗体或单域抗体（single domain antibody，sdAb），纳米抗体（Nanobody, Nb）晶体为2.5nm，长4nm，分子量只有15KDa。纳米抗体主要用于生物医药研发（基因工程药物研发、ADC药物研发）；用于临床体外诊断（胶体金法、酶联免疫吸附法、电化学发光法）；用于肿瘤研究、免疫学等基础研究领域，目前CAR-T治疗型抗体开发受到越来越多科研工作者的关注。

2.纳米抗体的优缺点

2.1 纳米抗体的优点

（1）在高温和pH下的稳定性；

（2）VHH可以识别通常不被常规抗体识别的抗原位点；

（3）它们的小分子片段有助于快速组织渗透和标记应用，包括跨越血脑屏障；

（4）用于大规模生产节约成本的替代品。

2.2纳米抗体的缺点

纳米抗体（VHH抗体）由于分子量较小，约为15kDa，相当于传统IgG抗体重链或轻链的可变区，因此针对VHH抗体的二抗不具有普遍适用性，需要将VHH融合Fc片段进行共表达进行解决二抗识别问题（卡梅德生物提供多种抗羊驼二抗，可用于免疫血清效价检测，Cat.#：SPAB01，SPAB03）

3.纳米抗体（VHH抗体）主要应用方向

基于纳米抗体优良的性能，目前被广泛应用于CAR-T治疗型抗体开发。

CAR-T疗法是嵌合抗原受体T细胞免疫疗法，这是一种治疗肿瘤的新型靶向疗法。通过基因工程技术，将T细胞激活，并装上定位导航装置CAR（肿瘤嵌合抗原受体），将T细胞这个普通“战士”改造成“超级战士”，即CAR-T细胞，他利用其“定位导航装置”CAR，专门识别并消灭体内肿瘤细胞，从而达到肿瘤治疗的目的。

4.卡梅德生物能够为客户提供高质量的驼源纳米抗体开发服务

卡梅德生物可以提供多种驼源纳米抗体开发服务，包括羊驼、大羊驼、骆驼、美洲驼等，基于噬菌体展示技术平台，卡梅德生物可以提供包括抗原设计、羊驼免疫、文库构建与筛选、活性功能验证等主要实验环节，并为科学家提供高特异性和高亲和力的羊驼VHH抗体。

5.卡梅德生物为客户提供驼源抗体开发的全流程介绍

主要包括以下步骤:羊驼免疫，噬菌体文库构建，抗体库筛选，抗体表达与功能验证。详细流程如下:

5.1羊驼免疫

卡梅德生物提供健康的成年羊驼（28-36月大）进行免疫，约16-20周即可获得高质量的文库和单抗细胞株，交付完整的实验过程记录和免疫动态视频。卡梅德生物根据客户的抗原类型，会制定特定的免疫抗原制备方案以及免疫方案。

5.1.1抗原准备：客户提供抗原，弗氏佐剂的使用量是1ml，将抗原和佐剂以1:1混合进行免疫。

5.1.2羊驼免疫:免疫5次，每次间隔20天，在羊驼颈部进行注射，免疫后1小时观察羊驼是否有不适症状。

5.1.3采血：免疫前进行采血，留作阴性对照，在第三、第四次免疫后间隔一星期进行采血5ml效价测定，ELISA检测血清效价，效价满足要求＞105。卡梅德生物为客户提供清晰的免疫时间节点信息表，如表1所示：

表1：卡梅德生物纳米抗体制备免疫时间进程举例

5.1.4PBMC细胞分离：取外周血100-120mL，PBMC细胞总数为4*107-108个，全部邮寄给客户。

5.2噬菌体文库构建

卡梅德生物使用M13噬菌体的pIII蛋白进行VHH抗体（纳米抗体）表面展示，制备TG1电转化感受态细胞，构建噬菌体载体，并进行噬菌体库容测定。

5.2.1RNA提取：按照商业化试剂盒操作进行RNA提取。

5.2.2CDNA反转录合成：按照商业化试剂盒操作进行cDNA制备。

5.2.3PCR扩增：以cDNA为模板，PCR扩增重链抗体基因可变区，扩增2轮。

5.2.4连接载体并电转化：酶切、连接噬菌粒载体，电击转化TG1宿主菌，构建抗体库。

5.2.5细菌文库/噬菌体文库建立：计算库容量，库容量交付标准108～109。

5.3抗体库筛选

常规使用的筛选方法是固相筛选，磁珠和细胞筛选（常用于GPCR，离子通道受体的抗体筛选）。

卡梅德生物为客户提供定制化的筛选体系，根据客户的需求不同，我们提供固相筛选，固相/液相筛选以及细胞筛选的方法。前两者适用于蛋白，多肽一类靶抗原的筛选；第三种适用于GPCR，离子通道受体的抗体筛选。通过不同的筛选方法，可以为客户高效的筛选出不同类型的阻断型抗体

5.4抗体表达与功能验证

5.4.1表达：构建哺乳表达体系进行抗体表达，卡梅德建立了完善的哺乳表达体系，包括但不限于FreeStyle 293-F cell line和Expi CHO-S等细胞系，配合卡梅德设计的高表达载体（含有全长的CMV启动子以及优化后的分泌信号肽序列）进行重组抗体表达与制备。

5.4.2纯化：纳米抗体过镍柱纯化。

5.4.3亲和力测定：将纯化好的纳米抗体进行Biacore亲和力检测。

卡梅德生物科技（天津）有限公司于2014年成立于中国天津，在西北地区拥有大型的羊驼养殖基地，公司每年为科研用户提供200+羊驼纳米抗体制备服务，制备周期短，约16-20周即可获得高质量的文库和单抗细胞株，可交付VHH抗体文库2ml，库容量高达108-109，欢迎广大科研用户朋友来咨询。