氨基酸分析仪检测奶粉中的乳清蛋白

   摘要   

本次实验数据均来自Biochrom氨基酸分析仪的国内某行业龙头客户，基于行业工艺、数据安全性等商业机密原因，不便透露不限于谱图、敏感数据等过多信息，还望见谅。

本次测试样品为奶粉，使用Biochrom30+全自动氨基酸分析仪，对我们所关注的样品中乳清蛋白所占总蛋白含量的比重进行分析，默认所有蛋白含量=所测定氨基酸之和的含量，并据此作为其所含乳清蛋白的测定依据。结果表明该奶粉样品中乳清蛋白约占奶粉蛋白的73%，详细数据及结果见附件。

一、  样品前处理

1、所用试剂

1.1 Loading Buffer(上样液)：钠盐系统，pH 2.2

1.2 过甲酸溶液：30%双氧水+88%甲酸按(V:V=1:9)混合，于室温放置1h，再放到冰水中冷却0.5h，制备完尽快使用

1.3 偏重亚硫酸钠：33.6g/100mL

1.4 盐酸：6.0mol/L

1.5 氨基酸标准品

2、前处理设备

1）分析天平:精度为 0.0001g

2）移液枪及枪头

3）容量瓶及胶头滴管

4）0.22μm滤膜

5）一次性注射器

6）低范围pH试纸

7）离心机

3、样品制备（参考标准：AOAC 994.12-1997；ISO 13904）

样品为奶粉，而我们所关注的是其中的乳清蛋白所占总蛋白含量的比重，为了便于测试，我们默认将所有测定的氨基酸之和作为所测蛋白的含量，故为了准确测定样品中所含所有氨基酸，前处理做如下处理：

3.1 乳清蛋白的提取：

A. 从样品溶解完全的容量瓶内吸取样2mL，在4℃，6000r/min，下离心20min(去除乳脂层)，再置于15000r/min下离心60min(除去酪蛋白)，获得乳清部分

B. 处理后样品加入10mL 6.0mol/L盐酸溶液及几滴消泡剂

C. 抽真空状态下（游离氨基酸易氧化）以熔焊机封口，置于110℃烘干箱中水解24h

D. 冷却后液体转入50mL容量瓶，反复冲洗水解管、漏斗、玻璃棒等，定容至50mL

E. 取定容后溶液2mL至蒸发皿中，加热蒸干后再加少许水，反复1-2次

F. 加入2mL 上样液，混匀后过0.45μm滤膜，上机待测

3.2 酸水解前处理：

A. 称取50-75mg(约含蛋白质7.5-25mg)的样品于20mL安瓿瓶中(切勿贴壁)

B. 加入10mL 6mol/L盐酸，抽真空至小于7Pa后封口(或氮吹将瓶内空气排掉亦可)

C. 封口后的安瓿瓶放入110℃恒温干燥箱内水解22-24小时

D. 冷却、混匀、开管、过滤、定容，取适量滤液置于旋转蒸发仪中，60℃以下抽真空，旋蒸干，加少许水，反复1-2次

E. 加入2mL上样液，混匀后过0.45μm滤膜，上机待测

注：也可以使用浓缩仪取代D

3.3 氧化水解前处理：

A. 称取50-75mg(约含蛋白质7.5-25mg)的样品于20mL安瓿瓶中(切勿贴壁)

B. 置于0℃冰水中加入2mL预冷的过甲酸溶液，加液时需将样品全部润湿，但不能摇动

C. 0℃冰箱中反应16小时

D. 加入33.6%偏重亚硫酸钠溶液0.5mL，混匀后，直接加入17.5mL 6.0mol/L盐酸，封口(无需抽真空)

E. 110℃恒温干燥箱内水解22-24小时(注：开始水解时安瓿瓶切勿封口，等水解1h后再封口，否则容易引起炸裂)

F. 冷却混匀开管，用水将内容物定量转移至50mL容量瓶中，用7.5mol/L的氢氧化钠中和至pH2.2，再用上样液定容混匀，0.45μm膜过滤后，供上机用

G. 氧化水解过程中，Tyr将被完全破坏，His部分被破坏。但是会保留Cys和Met

二、分析方法描述（Biochrom 30+）

氨基酸分析仪分析方法参数：

1. 色谱柱：Biochrom Na型阳离子交换树脂柱，4.6x20cm

2. 分离程序：

3. 运行时间：分析时间+再生时间共88.39min

4. 反应单元温度：135°C

5. 检测波长：570nm、440nm同时检测

三、计算

样品测定液氨基酸的含量按式(1)计算:

Ci = Cs/As × Ai× F ························· (1)式中:

Ci ——样品测定液氨基酸i的含量,单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL);

Cs ——氨基酸标准工作液氨基酸s的含量,单位为纳摩尔每毫升(nmol/mL);

Ai ——试样测定液氨基酸i的峰面积;

As ——氨基酸标准工作液氨基酸s的峰面积;

F  ——样品稀释倍数。

附分析结果表：

因为酸水解前处理会破坏胱氨酸、蛋氨酸，色氨酸无法测出；氧化水解会破坏酪氨酸、组氨酸。所以为了确保实验的准确性，分别对样品进行酸水解和氧化水解，Z 终分别将两种方法测得的氨基酸含量之和作为相对应的蛋白质含量，即乳清蛋白/奶粉蛋白=Ox(Hyd)乳清蛋白AA/Ox(Hyd)奶粉蛋白AA。h

结果表

  全自动氨基酸分析仪  

由具有50年专业氨基酸分析制造经验的Biochrom公司生产。

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