翌圣E.coli DNA ligase,单链DNA建库新利器

2022-10-25 00:00:00 38阅读次数

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高通量测序又称下一代测序技术(Next-generation Sequencing, NGS)，它可以同时测定几十万乃至数百万条核酸分子序列，具有通量高、成本低、规模大等显著优势，应用范围非常广泛，目前已经成为全球主流测序技术。而E.coli DNA ligase作为其中的关键酶之一，发挥了至关重要的作用，接下来小翌将围绕E.coli DNA ligase的作用方式、应用场景等方面进行介绍。

什么是E.coli DNA ligase

E.coli DNA ligase以NAD＋为辅因子，可以在dsDNA之间催化3´ 羟基端和5´ 磷酸端形成磷酸二酯键。与T4 DNA ligase不同的是，E.coli DNA ligase对RNA的接受性差且对平末端底物DNA无明显连接活性，对黏性末端DNA连接或切刻修复具有高特异性。

图1. E.coli DNA ligase作用方式

E.coli DNA ligase的应用

E.coli DNA ligase由于其连接dsDNA黏性末端的高特异性，常被应用在cDNA文库构建、NGS单链DNA建库等技术中，前者经常用于功能基因的筛选、生物遗传功能、个体发育等研究领域，后者经常用于肿瘤检测、早筛领域。

一、cDNA文库构建

cDNA文库指的是生物某一发育时期所转录的全部mRNA反转录形成的cDNA集合，cDNA文库在研究某类特定细胞中基因组的表达转录以及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势。经典cDNA 文库构建的原理是：Oligo(dT)作为反转录引物获得cDNA第一链，以cDNA第一链为模板生成cDNA第二链，使用互补同聚物尾部使得cDNA片段插入载体中，构建cDNA文库。主要文库构建流程如下：

图2. cDNA文库构建流程

1) 将获取的mRNA使用逆转录酶，反转录为cDNA第一链，生成RNA-DNA杂交复合物；

2) RNase H切割降解RNA-DNA杂合链中RNA；

3) 以cDNA第一链为模板生成cDNA第二链。其中，E.coli DNA ligase可以连接由DNA聚合酶I扩增形成的cDNA片段之间的切口；

4) 使用末端脱氧核苷酸转移酶(Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, TDT)在载体以及cDNA片段加上可以互补的同聚物尾巴（如cDNA上的Cs），其中包含20-30个核苷酸序列，用于构建重组载体。

二、NGS单链DNA建库

E.coli DNA ligase也经常用于NGS单链DNA文库构建中。单链DNA文库构建的主要原理是在文库构建之前将dsDNA变性成为ssDNA，在ssDNA的3’端加上接头，然后通过二链合成、5’端连接接头，PCR扩增的方式获取上机所用的文库。这种文库构建方式不再受限于DNA末端的完整性，非常适合低起始量以及FFPE类样本的建库。除此之外，单链DNA建库技术也可以用于DNA甲基化文库的构建过程中，可以有效增加甲基化测序的灵敏度和准确性。

其中，末端脱氧核苷酸转移酶和E.coli DNA ligase共同参与目的DNA 3’端添加接头的过程。末端脱氧核苷酸转移酶可以催化ssDNA的3’羟基端加上同聚物尾巴，从而在E.coli DNA ligase的作用下与接头进行连接。以单链DNA甲基化文库为例，其构建流程如下：

图3. 单链DNA甲基化建库流程

翌圣的E. coli DNA ligase是针对DNA片段和接头连接开发的连接酶，该酶具有低残留、高纯度的特点，可以在NGS单链DNA建库中进行高效连接。

性能展示

1. 无切口酶残留

检测结果显示E.coli DNA ligase无切口酶残留。

图4. 切口酶残留检测结果

2.高纯度

SDS-PAGE跑胶结果检测E.coli DNA ligase纯度，从左至右依次是在相同浓度下不同体积的（1 µL、2 µL、3 µL）的结果，结果表明其纯度＞95%。

图5. 纯度检测结果

3.客户反馈数据：优异的建库性能

图6中左图为分别使用翌圣两个批次酶Yeasen-1（橙）、Yeasen-2（灰）和竞品T（蓝）进行10 ng、100 ng 单链DNA起始量建库纯化后文库产量。右图为分别使用翌圣两个批次酶Yeasen-1（橙）、Yeasen-2（灰）和竞品T（蓝）进行10 ng、100 ng Bisulfite DNA起始量建库纯化后的文库产量。可以看到与竞品T相比，翌圣两批次E.coli DNA ligase在单链DNA建库及Bisulfite DNA建库文库产量更高，表现更优异。

图6. ssDNA、Bisulfite DNA建库数据

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参考文献

1. Lehman IR. DNA ligase: structure, mechanism, and function. Science. 1974 Nov 29;186(4166):790-7.

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5. Tabor S. DNA ligases. Curr Protoc Mol Biol. 2001 May;Chapter 3:Unit3.14.

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