【THUNDER小课堂】研究肺血管疾病

对小鼠肺组织进行高对比度快速成像，可以对肺血管系统的内皮网络和支持细胞进行可视化研究。

本文介绍了在小鼠肺标本中如何利用THUNDER Imager 3D Cell Culture荧光显微镜和即时光学解析（ICC）技术有效地研究控制肺血管形成和维持的细胞和分子机制，以及当肺血管疾病发生时出现的相应问题。肺血管系统是由内皮细胞组成的分支管状网络，这些内皮细胞排列在血管上，和支持细胞构成了血管壁。

从健康角度来看，识别在肺动脉、静脉和毛细血管发育过程中形成肺血管的细胞群类型是很有趣的，有助于它们的维持和修复，以及研究这些细胞的行为和调控信号。

小鼠肺组织图像：（左）原始宽场图像和（右）使用Instant Computational Clearing（ICC）技术后的THUNDER高清图像。图片来源：美国加利福尼亚州Ross Metzger博士。

   简  介   

肺血管疾病的研究涉及多种方法来探索影响疾病的细胞和分子程序[1，2]。肺血管从胚胎期开始发育，并在出生后继续。肺的支管网络由内皮细胞和支持细胞组成。为了更好地了解血管疾病，科学家研究了形成肺血管的细胞，以及那些有助于血管修复的细胞[1，2]。

由于管状结构，以及肺标本很容易有数百微米厚，因此可视化内皮细胞和支持细胞网络的发育以及血管系统的维持极具挑战。此处的报告结果展示了如何使用THUNDER Imager 3D Cell Culture显微镜，在小鼠肺组织中有效研究肺血管疾病的机制[3，4]。

   挑 战   

在肺组织成像时想要获得真实结果，拥有一种可以快速获取高对比度三维图像的解决方案非常关键，确保其中的重要细节得到清晰呈现。传统的宽场显微镜能够对这些厚标本的大面积成像，这种显微镜速度快，检测灵敏度高，但由于非焦信号的干扰，图像模糊，对比度显著降低[3，4]。

   方 法   

使用THUNDER Imager 3D Cell Culture显微镜对小鼠肺部标本进行成像。使用FITC、Cy3以及Alexa 633对标本进行免疫染色。为了可视化整个肺组织标本，使用20x Plan Fluo Apo 0.4 NA（数值孔径）物镜以及三个荧光通道。为覆盖280µm厚度的样品，采集的图像显示为由115层光学切片组成的扩展景深（EDoF）投影。

   结 果   

THUNDER Imager 3D Cell Culture可以快速获取肺组织的三维图像，然后通过Instant Computational Clearing（ICC）技术去除宽场图像中会降低对比度的模糊信号（参见图1）[3，4]。ICC可以呈现肺组织图像中的精细结构和细胞水平分辨率，以研究影响肺血管疾病的发育、维持和修复活动[1，2]。

整个组织图像采集时间约1min（参见图1）。

图1：小鼠肺组织标本的扩展景深（EDoF）投影：A) 原始宽场图像，B) Instant Computational Clearing（ICC）后的高清图像。

图片来源：美国加利福尼亚州Ross Metzger博士。

结论

使用THUNDER Imager显微镜的Instant Computational Clearing（ICC）技术[3，4]可以对小鼠肺血管疾病相关的细胞机制进行有效研究。因为与传统的宽场成像相比，该技术显著提高了图像对比度。

References：

1.L.C. Steffes, A.A. Froistad, A. Andruska, M. Boehm, M. McGlynn, F. Zhang, W. Zhang, D. Hou, X. Tian, L. Miquerol, K. Nadeau, R.J. Metzger, E. Spiekerkoetter, M.E. Kumar, A Notch3-Marked Subpopulation of Vascular Smooth Muscle Cells Is the Cell of Origin for Occlusive Pulmonary Vascular Lesions, Circulation (2020) vol. 142, no. 16, pp. 1545–1561, DOI: 10.1161/CIRCULATIONAHA.120.045750.

2.M. Boehm, X. Tian, Y. Mao, K. Ichimura, M.J Dufva, K. Ali, S. Dannewitz Prosseda, Y. Shi, K. Kuramoto, S. Reddy, V.O. Kheyfets, R.J. Metzger, E. Spiekerkoetter, Delineating the molecular and histological events that govern right ventricular recovery using a novel mouse model of pulmonary artery de-banding, Cardiovascular Research (2019) vol. 116, iss. 10, pp. 1700–1709, DOI: 10.1093/cvr/cvz310.

3.J. Schumacher, L. Bertrand, THUNDER Technology Note: THUNDER Imagers: How Do They Really Work? Science Lab (2019) Leica Microsystems. 

4.L. Felts, V. Kohli, J.M. Marr, J. Schumacher, O. Schlicker, An Introduction to Computational Clearing: A New Method to Remove Out-of-Focus Blur, Science Lab (2020) Leica Microsystems.