中国计量院自研数字PCR检测方法 为新冠病毒“漏检”开辟新思路

临床测定技术的发展主要在于方法学的发展，而方法学的发展依托于试剂生产技术不断进步更新和型标记物的应用。分子生物学正在并肯定会让对整个生命科学有一个全面而彻底的认识，其对免疫测定技术发展的影响也是直接而又有效的，对以前一些难以检测的生物活性物质的测定，并且大大提高了检测的灵敏度和特异性。

针对检测新型冠状病毒，中国计量院研发了高灵敏数字PCR检测法和检测试剂盒。主要基于数字PCR系统完成相应的引物、探针、阴性对照、阳性对照、内参基因设计及优化等工作，为解决“漏检”问题开辟了新思路。

引物

在核苷酸聚合作用起始时，刺激合成的一种具有特定核苷酸序列的大分子，与反应物以共价键形式连接，这样的分子称为引物。引物通常是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与靶区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与靶区域另一端的另一条DNA模板链互补，其功能是作为核苷酸聚合作用的起始点，核酸聚合酶可由其3端开始合成新的核酸链。体外人工设计的引物被广泛用于聚合酶链反应、测序和探针合成等。

探针

一小段单链DNA或者RNA片段(大约是20到500bp)，用于检测与其互补的核酸序列。双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素(通常用磷-32)、荧光染料或者酶(如辣根过氧化物酶)标记成为探针。磷-32通常被掺入组成DNA的四种核苷酸之一的磷酸基团中，而荧光染料和酶与核酸序列以共价键相连。当将探针与样品杂交时，探针和与其互补的核酸(DNA或RNA)序列通过氢键紧密相连，随后，未被杂交的多余探针被洗去。，根据探针的标记物种类，可进行放射自显影、荧光发光、酶联化学发光等方法来判断样品中是否，或者何位置含有被测序列(即与探针互补的序列)。

阴性对照

是针对“预期结果”而说的。凡是肯定出现预期结果的组，为阳性对照组。凡是肯定不会出现预期结果的组，为阴性对照组。空白对照(blank control)是针对“处理因素”而说的。凡是不加处理因素的组，为空白对照组。所谓不加处理因素，可以是用生理盐水等溶剂代替所要加的溶液，也可以是给实验动物开刀但是不摘除某个器官，等等。阴性对照和空白对照不一定能画等号。两者的区别在于，空白对照没加处理因素，阴性对照加的是别种处理因素。

阳性对照

是一种干预方法，比如一种药物、疗法或医疗器械，这种干预方法的有效性以前已经是明确的，只是为了说明新疗法的有效性。与阴性对照相比，阳性对照是与要进行的实验内容很相似但不相同，而且其由经验可以预见其结果，即应该得出正面的结果。

数字PCR系统

是一种核酸分子定量技术。当前核酸分子的定量有三种方法，光度法基于核酸分子的吸光度来定量;实时荧光定量PCR(Real Time PCR)基于Ct值，Ct值就是指可以检测到荧光值对应的循环数;数字PCR是的定量技术，基于单分子PCR方法来进行计数的核酸定量，是一种定量的方法。主要采用当前分析化学热门研究领域的微流控或微滴化方法，将大量稀释后的核酸溶液分散至芯片的微反应器或微滴中，每个反应器的核酸模板数少于或者等于1个。这样经过PCR循环之后，有一个核酸分子模板的反应器就会给出荧光信号，没有模板的反应器就没有荧光信号。根据相对比例和反应器的体积，就可以推算出原始溶液的核酸浓度。

基于“单分子模板扩增反应”计数原理，通过芯片式分散体系，在两万个微反应器中对目标序列进行充分的分隔，通过鉴定阳性及阴性扩增结果比例和专用算法统计，能以定量的方式直接鉴定核酸靶分子的含量，具有比普通实时定量PCR更好的检测灵敏度、扩增特异性和定量精确性。

该系统适用于极微量核酸的定量检测、复杂样品中稀有碱基序列的定量检测、微小差异核酸拷贝数精确鉴定等研究领域，可以达到传统荧光定量实时PCR技术不能达到的分辨率和精准定量的效果。

实时荧光定量PCR

所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

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