双荧光素酶报告基因检测（一）

        双荧光素酶实验是广大科研工作者经常会遇到的实验。双荧光素酶报告基因通常以萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）为报告基因，以海肾荧光素酶（Renilla luciferase）为内参基因。这样构建的报告系统具备很多优势，包括检测灵敏度高、动态范围广、应用灵活等。同时双荧光素酶实验也有很多应用比如蛋白与蛋白互作，miRNA靶基因验证，转录因子调控验证，ceRNA研究等多种研究。

荧光素酶实验的实验原理

      为了研究特定基因的转录调控元件，可以将这些元件插入到含有萤火虫荧光素酶（Firefly luciferase）的表达载体中，从而创建一个报告基因质粒。这使得所研究的序列能够调节荧光素酶基因的表达。接着， 通过将这个报告基因质粒转入细胞，并对细胞施加不同的实验处理，可以分析这些调控元件的功能。处理后，细胞被裂解，并加入荧光素底物（luciferin），此时荧光素酶能催化荧光素产生荧光（主峰波长约为560nm）。通过测量荧光强度，可以评估不同处理对这些转录调控元件的影响。

     为了消除因质粒转染效率差异而引起的实验误差，常常会同时引入Renilla荧光素酶基因的报告基因质粒作为内部对照（其荧光主峰波长在465nm左右），形成一个双荧光素酶报告系统。这种方法可以提供更准确和可靠的实验数据。

 荧光素酶实验的发光机制

       荧光素酶是一种在自然界发光生物体内发现的酶，负责催化荧光素（luciferin）或脂肪醛（firefly aldehyde）进行氧化反应以产生光。这类酶在多种发光生物中存在，包括荧火虫、发光海星、发光节虫、发光鱼和发光甲虫等。由于细菌荧光素酶对温度敏感，其在哺乳动物细胞中的应用受到一定限制。目前，广泛应用于各种研究的是源自北美萤火虫（photinus pyralis）的荧光素酶基因，它编码一个由550个氨基酸组成的荧光素酶蛋白，这是一个61Kda的单体酶，无需进行表达后修饰即可表现完全的酶活性。

发光机制:

      生物体的发光机制本质上是一种化学发光过程。在ATP、Mg2+和O2的协助下，萤火虫荧光素酶催化D2荧光素（D2 luciferin）进行氧化脱羧反应，产生激活状态的氧化荧光素，并伴随着光子的释放，从而发出550-580nm波长范围内的荧光。化学反应式如下：

萤光素酶实验步骤

1、 构建载体：在报告基因质粒的制备中，将目标序列插入带有荧光素酶的报告基因载体，例如pGL3-basic。

2、 转染质粒：将制备的报告基因质粒与phRL-TK（作为内部参照）一同转入细胞中。根据实验的需求对细胞进行相应处理。在共转染过程中，由于内参质粒含有强启动子，通常报告基因质粒与内参的比例约为10:1到50:1。

3、 细胞裂解：使用PLB裂解液（Passive Lysis Buffer）进行细胞裂解，该溶液能有效裂解培养的哺乳动物细胞，无需刮取细胞或进行冻融循环，同时一定限度地保持荧光素酶活性并降低自发光，从而提高实验的灵敏度，适用于低水平的海洋腔肠荧光素酶的定量。

4、 底物添加：制备LAR II（萤火虫荧光素酶的底物）和Stop&Glo（海洋虫荧光素酶的底物），后者能够终止LAR II的反应。

5、 荧光检测：使用荧光发光仪进行检测。

6、 数据分析：首先计算每个样本的萤火虫荧光素酶与海洋虫荧光素酶的比值，然后以对照组的比值作为基准1，从而计算不同实验组的相对荧光素酶活性，这反映了不同处理对基因转录调控的影响。

萤光素酶实验具体应用

1、microRNA与mRNA的相互作用验证：将目标基因的3'UTR区域克隆到荧光素酶报告基因载体中，然后将其与相应的microRNA一起转染入细胞。如果荧光素酶的活性降低，这表明该3'UTR可能是microRNA的靶点。

2、microRNA与lncRNA的靶向互作验证：把待研究的lncRNA序列插入到报告基因载体的3'UTR部分，并监测荧光素酶活性的变化。

3、启动子的结构分析：通过将约2千碱基对左右的启动子区域进行切割或突变，并将其插入到荧光素酶报告基因载体中，来分析不同片段对荧光素酶活性的影响。

4、启动子SNP分析：对于存在单核苷酸多态性（SNP）的基因启动子区域，可以使用荧光素酶报告系统来评估它们的相对活性。

5、信号通路激活验证：将特定信号通路的下游组分序列克隆到报告基因载体中，通过测量不同上游条件下荧光素酶活性的变化来评估该信号通路的反应情况。

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