双荧光素酶报告基因检测（四）

      启动子能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性；转录因子（TFs）调节基因表达，保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。将启动子区域序列插入到报告基因载体（常用载体为pGL3-Basic Vector，将待检测的启动子序列构建在报告基因上游），同时在细胞实验中共表达转录因子，分析荧光素酶表达水平，反应转录因子是否影响基因表达情况。

转录因子与基因启动子相互作用

       转录因子与基因启动子相互作用的研究属于转录调控方面的研究，也是研究相对集中的基因表达调控方式。转录调控分析不能盲目地为了研究具体机制而做研究，需要与基因功能研究密切联系起来作为前提条件。

      荧光素酶报告基因分析可以有效地在体外评估转录因子调控启动子的能力。对于转录因子与启动子互作验证，目前普遍采用基于pGL3-basic载体的双荧光素酶报告基因系统。当然，如果目的启动子活性较强，使用pGL3-basic即可；若启动子活性较弱，可以选择带有强启动子的pGL3-enhancer或promoter载体。pGL3-basic系统需要用到三种质粒：

（1） pGL3-basic：带有目标启动子序列的报告质粒，萤火虫荧光素酶(fLuc)作为报告基因；

（2） pRL-TK：内参质粒，海肾荧光素酶(rLuc)作为内参基因，使fLuc的检测均一化；

（3） pcDNA3.1：转录因子过表达质粒。

      构建好以上三种质粒后，共同转染转染至哺乳动物细胞。用于报告基因分析的细胞可以选择具有转染效率高、易培养等优点的工具细胞，如HEK293细胞，这已得到广泛的认可，也是较为常见的做法。当然也可以使用实验所用的目的细胞，或根据个人实际情况选择常见、合适的细胞。

①　将靶启动子片段插入到萤火虫荧光素酶表达序列前方，构建实验报告基因质粒；

②　将要检测的转录因子表达质粒与两种报告基因质粒共转染相关细胞；

备注：如果此转录因子能够激活靶启动子，则萤火虫荧光素酶基因就会表达，并且萤火虫荧光素酶的表达水平与转录因子的作用强度成正比。

③　经细胞培养后裂解细胞，离心取上清，随后分别加入两种荧光素酶底物，荧光素酶与底物反应产生荧光，通过检测荧光的强度测定荧光素酶的活性，从而判断转录因子是否与该启动子存在相互作用。

转录因子与基因启动子相互作用

       关于靶基因启动子序列，通常选取转录起始位点上游2000bp的区域作为启动子区，再运用预测转录因子与启动子结合的数据库分析二者结合的可能性及潜在结合位点，常用的数据库有JASPAR（推荐）、PROMO等。那么转录因子与启动子互作分析一般可以有以下几个方面。首先可以初步明确转录因子对靶基因具有转录激活或转录抑制作用；接着需要明确转录因子的结合位点，就必须构建启动子的截短体或突变体等，分别进行验证双荧光素酶验证分析。一般情况下，转录因子都具有转录激活/抑制结构域和DNA结合结构域，可以针对这两个区域构建转录因子突变体，通过比较野生型和突变型转录因子的调控能力，研究其转录调控能力。

1、 构建全长启动子分析：明确转录因子对靶基因启动子的转录调控作用。

2、 构建启动子截短体分析：将启动子上转录因子的潜在结合位点进行缺失，构建启动子截短体，与全长启动子比较，明确缺失区域是否在转录因子发挥作用的重要位置。

3、 构建启动子点突变分析：通过启动子的截短体我们可以验证转录因子的转录调控作用是否与潜在结合位点相关，随后可以进一步对这些潜在结合位点进行点突变，探讨结合位点碱基突变是否影响转录因子对靶基因的转录调控能力。

4、 构建转录因子突变体分析：另外还可以构建转录因子相关功能域的突变体或截短体，研究转录因子的功能结构域。

       另外，实验设计分组也是比较关键的，只是明确转录调控关系一般分四组，进一步研究结合位点则每研究一个位点就增加两组实验。

      卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://www.kmdbioscience.cn/)建立了完善的细胞培养平台，能够提供给客户多种细胞学基础实验，可以提供优质的免疫检测服务—双荧光素酶标记基因检测。

我们从以下文献来进行进一步分析：

案例

      文献标题：Interruption of TRPC6-NFATC1 signaling inhibits NADPH oxidase 4 and VSMCs phenotypic switch in intracranial aneurysm . DOI：10.1016/j.biopha.2023.114480

      安徽医科大学李维祖教授在研究颅内动脉瘤时发现NOX4在TNF-α诱导的A7R5细胞中被激活，减慢TRPC6-NFATC1信号通路可显著下调NOX4的表达。为验证NFATC1与 NOX4的结合机制，作者通过人转录因子数据库（HumanTFDB）预测到NFATC1在人NOX4启动子区域可能结合的3个位点。利用pGL3-basic构建了这3个可能结合位点（TFBSs）及相应位点突变的报告载体。结果显示NFATC1可以直接结合NOX4启动子，参与NOX4转录，并确定了NFATC1可以结合到NOX4启动子的TFBS2和TFBS3上，调控NOX4的转录。这些发现为了解颅内动脉瘤的发病机制和延迟颅内动脉瘤的必要策略提供了依据。

图1. NFATC1与 NOX4启动子的双荧光素酶验证

      文献标题：Long noncoding RNA KB-1460A1.5 inhibits glioma tumorigenesis via miR-130a-3p/TSC1/mTOR/YY1 feedback loop. DOI:10.1016/j.canlet.2021.10.033

      李庆国发现在胶质瘤中KB-1460A1.5表现为低表达情况，为了解析这一机制，作者对KB-1460A1.5上游区域进行了分析。首先通过PROMO网站筛选了可能与KB-1460A1.5结合的转录因子，并通过这些因子在胶质瘤中的表达与KB-1460A1.5的相关性分析发现YY1极有可能参与调控KB-1460A1.5的表达。通过构建YY1过表达载体及KB-1460A1.5启动的pGL3载体进行双荧光素酶报告基因检测验证。结果显示，YY1可能与KB-1460A1.5启动子结合，且YY1降低了KB-1460A1.5启动子的荧光素酶活性，即YY1可能以负调控的方式调控KB-1460A1.5的转录表达。作者进而提出了KB-1460A1.5在胶质瘤中的作用机制，KB-1460A1.5可能是胶质瘤的治 疗 靶点。