双荧光素酶报告基因检测（五）

关于双荧光素酶报告基因检测中遇到的问题及解决措施

       问题1：为什么要用荧光素酶实验来做检测，不用其他报告基因来做，GFP可以吗？

        采用荧光素酶来做实验是由其自身的优势所决定的：（1）蛋白不需要翻译后加工，所以一旦翻译立即 产生报告活性；（2）在所有的化学发光反应中，它的光产物具有Z高的量子效率，因而非常灵敏。另外，在宿主细胞及检测试剂中均检测不到背景发光；（3）检测快速，每个样品只需几秒钟。以上优势使其成为广大科研工作者做相关验证实验的选择，其他报告基因由于种种缺陷一般不作为研究手段。

     问题2：双荧光素酶实验为什么要加luciferase底物（luciferin）？

     因为我们构建的双荧光素酶系统是催化酶，要发光需要底物，催化酶催化底物才能产生荧光。

      问题3：为什么要用两个荧光素酶，海肾荧光素酶的作用是什么？

      通过利用荧光素酶与其底物结合发生的化学发光现象，可以将目标基因的调控序列克隆到萤火虫荧光素酶（firefly luciferase）基因的上游，从而创建一个荧光素酶报告质粒。为了降低实验中如细胞培养数量、活性差异，以及转染和细胞裂解效率等内在变量对结果的影响，使用含有海洋虫荧光素酶（Renilla luciferase）基因的质粒作为内部对照。这样，通过共转染这两种报告基因到细胞中，可以确保获得的转录活性数据更加稳定，减少实验条件波动所带来的影响。

      问题4：转染成功如何判断？

     在共转染多个质粒的实验中，通过测定Z终的荧光素酶（luciferase）活性值，可以判断3' UTR质粒和Renilla质粒的转染效率。然而，对于miRNA质粒或miRNA模拟物（mimic），其转染效果不能仅从荧光素酶读数直接判断。为了验证miRNA的转染效果，可以采取以下几种方法：(1) 如果转入的miRNA带有如GFP等荧光标记，可在细胞裂解前通过显微镜观察细胞内的荧光情况；(2) 若转入的miRNA没有荧光标记，则可以通过进行miRNA的定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）检测，比较实验组与对照组中miRNA的表达差异，以此判断其过表达情况；(3) 另外，可以设置一个带荧光标记的质粒作为转染效率的参照，与目标细胞同时进行转染，从而间接评估整个实验批次中的转染效率。

     问题5：如何判断实验体系无异常？

      可以从以下几个方面来考察实验结果的客观性：

      对照的2个实验组，即实验组1与实验组2 luc表达情况应无显著差异；转染正常，质粒或mimic确保成功转染入细胞；luc检测值在仪器检测线性范围内。

     问题6：阴性结果如何理解？

     在确保实验体系无异常的前提下，如果Z后检测到的结果是阴性结果，则基本可以判断目的miRNA不能直接调控靶基因的表达，不死心的话就再做一次

     问题7：实验体系是否可以优化？

     该实验的关键点在细胞状态和转染效率，转染效率的优化可通过调整共转染质粒的比例或调整转染体系来进行，设置合理的质粒转染量梯度，观察microRNA对靶基因的抑制是否存在剂量效应或是否存在变化趋势的一致性，从而使结论更加可靠。

      问题8：使用mimics的一些问题？

      可以使用mimics来做实验，其实mimics就是体外合成的成熟体miRNA，同样可以反转录，用qRT-PCR来检测表达量，但是大家应该很少看到有文章把mimics的过表达量PCR结果放出来的吧，那是因为mimics的过表达通常在数万到数十万倍，miIRNA通常会靶向结合许多靶基因，这么强的外源过表达肯定会引起严重的脱靶效应，给审稿人把柄质疑你吗？对于这种找抽的行为大家肯定是积极规避的。质粒介导的miRNA过表达由于是模拟了前体在生物体内的剪切，其过表达通常在数十倍到数百倍，可能引起的脱靶效应远没有mimics严重。

      问题9：其他调控方法

      是否还有其他方法验证miRNA对靶基因表达的调控？验证miRNA对靶基因的调控，也可直接检测miRNA过表达或下调表达后，靶基因在mRNA（qRT-PCR方法）或蛋白水平上的变化（Western Blot方法）。

      问题10：关于荧光的问题-荧光值过高

     荧光值过高可能会超出仪器检测范围，从而检测不到值，一般读数在5-6位之间较好。荧光值过高可通过以下方式尝试解决：

1.减少质粒转染量；

2.细胞样品裂解后，离心取上清后检测或对裂解产物进行稀释后检测。

（注：不建议通过减少底物量来降低荧光值，需要保证底物的饱和来反映荧光素酶真实的表达水平，否则会造成检测结果出现大的偏差。）

       问题11：双荧光素酶的Z终数值怎么处理？

       通常比较双荧光素酶各组的数值，是需要对萤火虫荧光检测的数值和海肾荧光进行归一化反应，归一化反应的计算数值为两者的比值。

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