测序上游突围之国产生物分析仪，加速测序全流程国产化

使用福 尔马林固定石蜡包埋处理的样本（Formalin-Fixed and Parrffin-Embedded，FFPE）可以保存原有正常的组织结构和功能，并且能在常温保留很久。大部分FFPE样本主要与肿瘤相关，随着精 准医疗对病理科的影响渗透，以及研究手段的不断升级，研究人员对积攒了数年之久的FFPE样本在分子层面的研究也越来越多，研究这些组织样本为探讨新的肿瘤分类、诊断和预后标准，开发肿瘤早期检测的实验技术、转化医学和个体化医学提供了有利的依据。但FFPE样本特殊的制作方法和保存过程都对样本中的核酸造成多方面的影响，尤其是DNA和RNA的降解问题。

二代测序技术的飞速发展大大地提高了样本测序速度，降低了测序成本，也使得应用二代测序方法对FFPE样本中的DNA和RNA进行测序成为可能。由于从FFPE样本中提取出的核酸样本比较特殊（有可能降解严重，完整性较差），因此对FFPE样本的质控成为文库构建以及能否测序成功的关键。

图1.不同平台二代测序流程。

FFPE样本中提取的gDNA一般会从浓度、纯度和片段完整性三个方面进行质控。浓度和纯度可以通过EzDrop 1000超微量分光光度计这类仪器进行质控，提供核酸样本的A230、A260和A280数据，然后通过A260/230和A260/280的比值来判定样本的纯度。对于DNA样本，A260/A280为1.8-2.0，说明样本纯度是合格的；A260/A280<1.6，说明有蛋白质或酚等污染；A260/A280>2，说明RNA没有除干净或DNA已变性。对于RNA样本， A260/A280为1.8-2.0，说明样本纯度是合格的；A260/280＞2.0则说明RNA可能已经存在降解；A260/280＜1.8则说明有蛋白质或其他杂质残留。

图2.Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统（生物片段分析仪）

FFPE样本的完整性质控方面，则可以通过Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统（生物片段分析仪）完成。

Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统，又称生物片段分析仪，全自动毛细管电泳仪。2016年，中国台湾光鼎在江苏成立合资公司江苏光鼎，完成了NGS质检仪器国产化生产，且产品已获得医疗器械注册证。至此，Qsep设备耗材可由光鼎江苏分公司直接供货，为广大生物分析仪的使用者带来前所未有的便利。

DNA质量评分：DQN

通过计算基因组质量评分DQN（DNA Quality Number），可以高效地评估gDNA的质量。由Qsep开发的片段分析仪，其数据分析软件可评估每个样本与用户定义的特定应用阈值用于“高质量的DNA”评分，并指定0到10之间的DQN值。数值反映高于定义的阈值的DNA的百分比。

对于FFPE提取的gDNA样本，Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统软件具有基因组DNA质量评分值（DQN）系统，可以高效评估FFPE基因组样本质量。可为样本库中评价核酸的质量标准提供数字化的标准。

图3.不同质量gDNA样本DQN值比较（FFPE提取），左图：DQN:7.2，右图：DQN:9.9。

RNA质量评分：RQN

Qsep全自动核酸蛋白分析系统有两个指标可用于评估RNA的质量。首先是软件计算RNA质量评分数值RQN（RNA Quality Number），RQN值范围为1到10， 是基于专有的计算算法，考虑RNA电泳图谱的整个分布。

图4. 不同质量RNA样本RQN值比较，左图：RQN:2.03，右图：RQN:9.5。

图5.total RNA样本梯度稀释结果。

虽然RQN值是从新鲜组织分离的RNA质量的可靠质控标准，但它们并不是福 马林固定的石蜡包埋（FFPE）样本的RNA质量的准确质控评价手段。为了解决这个问题，Illumina的科学家开发了DV200检测标准，可以计算RNA片段大于200nt大小的百分比。考虑到DV200值和二代文库产量之间的更强的相关性，与RQN值相比，DV200评分体系对于评估FFPE RNA质量是更为贴切的。Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统可以直接提供不同样本的DV200的数值。

图6.不同质量Total RNA样本DV200值比较（FFPE提取），左图：DV200：54.6%，右图：DV200：78.3%。

二、文库构建过程的质量控制  

结合Qsep提供的DQN值可判断是否可进行建库。根据不同大小的DQN数值也可设置不同的打断条件，以期获得稳定的符合预期的片段大小，将片段化后的样本按照标准流程进行文库构建，利用Qsep仪器可以分析文库片段大小的分布范围是否符合建库的要求（见图7）：左侧是一个正常的打断文库，右侧文库在打断中，没有打断彻底，导致文库整体片段偏大，不建议继续进行下一步验。

图7. 不同文库比较，左图：正常文库，右图：片段偏大文库。

图8.文库片段分布分析。

在上机前文库质控中，可通过Smear分析确定文库的主要片段分布区域，以及其平均片段长度。

在整个二代测序过程中，无论是对核酸的质控还是对文库打断样本和上机前文库的质控，Qsep系列全自动核酸蛋白分析系统可以为用户更简便，更准确地提供对应的数字化质控数据，为后续的高质量的测序数据提供保证。

近年来，国产测序设备企业奋力直追，积极布局，国产设备逐渐兴起，并在国内占据一定的市场份额。Qsep作为国内同类产品领跑者，已经与国外产品达到同一水平甚至有所超越。Qsep致力于更加灵活的通量、更简单的操作、更短的时间与更低的成本，为中国的测序前处理质控环节提供了强有力的支持和自信心。