克隆的那些事（下）

上回我们讲到载体与目的片段的制备就戛然而止了。载体与目的片段制备成功之后剩下的就是连接跟转化。

一步法同源重组原理上期我们已经讲过。接下来就该进行反应体系的计算，很多小伙伴在这一关就被难住了。反应体系的配置需要根据载体的碱基数以及插入片段的碱基数进行计算，不同公司的产品推荐的体系配置略微不同。这里就以翌圣的Hieff Clone® Universal One Step Cloning Kit（Cat.10922ES）为例，给大家讲解Hieff Clone® 重组反应体系如何配置。

Hieff Clone® 重组反应体系最适片段及载体插入总量为0.02-1 pmol，1-3片段为0.02-0.5 pmol，4-6片段为0.5-1 pmol。最适载体与插入片段摩尔比为1:3。对应的DNA质量可由以下公式计算获得：

线性化载体使用量ng = (插入碱基对数×0.65×总pmol) / (1＋3n)

插入片段使用量ng = (插入碱基对数×0.65×总pmol×3) / (1＋3n)

其中n表示插入目的片段数量。

举个例子：我们需将4个片段P1 (0.5kb)、P2 (1kb)、P3 (2kb)、P4 (3kb)插入长为5kb的载体中，取载体与片段总量为1pmol为例进行计算：

线性化载体最适用量为：(5000×0.65×1)/13 = 250 ng

插入片段P1最适用量为：(500×0.65×1)/13 = 25 ng

插入片段P2最适用量为：(1000×0.65×1)/13 = 50 ng

插入片段P3最适用量为：(2000×0.65×1)/13 = 100 ng

插入片段P4最适用量为：(3000×0.65×1)/13 = 150 ng

除了以上这些，这里有个小技巧分享给大家：计算好体系后，加入线性化载体和插入片段后，可以先42℃高温加热，促进分子扩散，增加我们的载体与插入片段碰到的机率，再快速冷却，最后加入含酶的Mix，混匀之后放入PCR仪器中进行反应。反应完的产物要尽快进行下一步实验，避免常温长时间放置。

转化一般分为化学转化和电转化两种。1970年Mandel和Hige发现大肠杆菌细胞经CaCl2溶液处理时能够吸收λ噬菌体DNA，细胞这种能够吸收DNA的状态称感受态。常见的两种转化如下图所示。

化学转化相信大家已经做过很多次，但是这里面始终有许多值得注意的小细节。将酶连产物加入到感受态细胞中的时候，要注意将移液枪的枪头置于液面以下，不要反复吸打避免造成本就脆弱的感受态细胞死亡。整个操作过程注意在冰上操作并且无菌。细胞化学转化的实验操作步骤如下图所示：

有些同学会出现平板上不长转化子或转化子很少的情况，那么该如何分析呢？首先思考一下培养基的问题，若培养基各组分添加的过多或过少以及培养基中抗生素类别使用错误或浓度使用过高，都会导致平板上不长或少长克隆。排除培养基的问题之后，再考虑使用的感受态是否存在效率低的问题。这个就要求我们在做实验的时候养好做正负对照的习惯。我们将未线性化的质粒载体转入感受态细胞中，并涂布在含抗生素的平板上作正对照。既可以排除感受态效率问题又可以排除培养基的问题。若整个操作过程一致，但正对照长，实验组不长，则需要考虑我们的整个酶连过程是否存在问题。若正对照和实验组都没有克隆，则需要检测操作过程是否出现错误或漏掉实验步骤等。

往期回顾：克隆的那些事（上）

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