一文解读——如何高效完成宿主细胞DNA残留检测

宿主细胞残留DNA是影响生物制品安全性的关键因素之一，它不仅会降低生物药的有效性，还可能带来传染性或致瘤性等安全问题。因此建立合适的宿主细胞残留DNA检测方法有助于监测生产工艺，确保生物制品的安全性和质量。在整个生产过程中，这种杂质会在以下几个步骤中发生(图1)。

(图一）生物制品研发生产过程中对于宿主细胞残留检测涉及的环节

各国药品监督管理机构对宿主细胞残留DNA的残留量有着严格的限度控制，因此都相继出台了有关生物制品中宿主细胞残留DNA的指南。其中，定量PCR法是中国2019年国家药典委员会确认的外源性DNA残留测定方法[1]，也是新版USP中推荐生物制品中宿主残留DNA的检测标准方法。

本文测试的Applied Biosystem resDNASEQ残留DNA定量试剂盒通过精确的qPCR手段可检测多个宿主细胞背景，但仍需要连续稀释和相对较大的反应体积（30ul）,尤其是多次移液工作中枪头液体残留会造成试剂的大量浪费。

为满足研究学者们对实验自动化以及高质量数据日益增长的需求，可以通过使用精确的移液新科技来改进此类工作流程 。本次引入的qPCR体系构建的新方法主要依靠无接触式纳升移液器Echo（原理如图二所示）提供的精确声转移能力，大大提高残余宿主细胞DNA检测工作流程，同时降低试剂耗材成本、提升实验效率。

1、无接触试微量移液原理展示：

(图二）声波移液——声能转换器位于母板孔下方，向待转移液体的液面发射聚焦声能， 精 准地将体积为2.5nL或25nL的液滴流（取决于使用设备型号）转移至倒置的目标微孔板中。

2、体系构建试剂配比（6倍缩小原体系）

（表三）resDNASEQ定量试剂盒两种不同稀释试剂盒检测CHO细胞的DNA直接稀释方案。

缩小反应体系后，使用resDNASEQ定量CHO试剂盒，使用两种不同的稀释液（92pg/nl、0.92pg/nl）进行CHO细胞测试的DNA直接稀释。

3、操作步骤与分析

Echo声学移液完成后，用Bio-Rad Microseal‘C’PCR密封每个PCR板板密封膜。然后以2000RPM对板进行短暂涡旋15秒。涡旋后，将板以1000xg离心2分钟，并立即放入Roche Lightcycler 480 II中。热循环运行完成后，使用Roche LightCycler 480软件进行分析。使用绝 对定量二阶导数算法完成分析。随后将CP值导入Graphpad Prism进行进一步分析和可视化。

（表四）Roche LightCycler 480 扩增程序

4、实验结果

（图五）qPCR 检测结果展示

A：每个样品做了三个重复，使用Echo 655T将样本转移到resDNASEQ试剂中，显示了多个数量级的结果，证明了再现性。每个反应的DNA投入量以皮克为单位标注在曲线上。

B：当CP值相对于DNA量绘制在半对数图，线性关系R2为0.9884的。各点之间的平均CP CV%为0.74%。

无接触式纳升移液器Echo以无接触方式对DNA残留进行qPCR试剂的低体积分配，可以快速分配和组装，节省实验耗材的同时满足复杂基因工程工作流程的需求，该方案的具体优势还包括：

• 缩小6X以上的qPCR试剂成本。

• 全流程移液无需移液枪头，减少耗材成本。

• 500-700次/秒的超快速移液，提高实验效率。

• 直接稀释，与液体无任何物理接触，减少交叉污染。

注：测试使用的仪器试剂材如下表

以上方案仅科研使用，不适用于临床诊断。

 ● 参考资料： 

[1] 国家药典委员会. (2019). 关于通则3407外源性DNA残留量测定法第三法的公示[2022-04-04].

 https://www.chp.org.cn/gjyjw/swzp/4914.jhtml.