层析纯化小课堂：凝胶过滤层析你知多少

2024-04-18 11:00:05 103阅读次数

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凝胶过滤层析 (Gel Filtration, GF) 又称尺寸排阻层析 (Size Exclusion Chromatography, SEC) 或分子筛层析，是一种常见的层析纯化方法。根据分子大小和形状的差异，在凝胶过滤层析柱中的分离速率不同，从而实现分离纯化的效果。

图1. 凝胶过滤填料结构与原理示意图：(A) 填料微观结构；(B) 凝胶过滤原理示意图；(C) 凝胶过滤分离效果示意图；(D) 凝胶过滤层析图谱

提供全新一代

Increase系列分子筛预装柱

专门为小规模制备纯化及分析而设计

除此之外，也提供了多种不同基架，不同性能表现的凝胶过滤层析填料及其预装柱产品。今天的层析纯化小课堂，主要聚焦凝胶过滤层析的产品选择指南与清洗维护，不容错过~

凝胶过滤层析产品选择指南

凝胶过滤层析产品的选择，主要聚焦于以下3个应用方向：

适用于分析纯化的产品：用于分析的样品，样品量比较少，而且对于纯度有极高的要求。所以，用于分析纯化的层析柱一般不会太高 (15–30 cm) ，上样体积在柱体积的0.3%-0.5%之间。体积小，高度适宜的层析柱可以在保证高分辨率的同时，减少运行时间，并节省样品和缓冲液的使用量。

适用于制备纯化的产品：相比而言，制备样品相对样品量稍大一些，对于纯度的要求较高但不必达到分析级纯度。所以，一般会选择用较高的层析柱（60 cm及以上）进行纯化，上样体积一般在柱体积的0.5%-4%。

适用于脱盐与缓冲液置换的产品：脱盐与缓冲液的置换，本质上就是大分子样品与小分子（离子）的缓冲液组分之间的分离。这种情况下，对于分辨率的要求相对不如前两种情况高，而且，由于分子量差异大，上样体积可以达到柱体积的30%。

图2. 经典高分辨凝胶过滤层析图谱

图3. 经典组分分离层析图谱

凝胶过滤层析产品

01 Sephadex

Sephadex系列填料，是Z早的凝胶过滤填料产品系列，按照填料基架交联度的不同，产品名称用Sephadex G加数字来区别 (如G-10、G-15等) ，数字越小交联度越大，形成的平均孔径越小，分离范围也会越小。目前，Sephadex填料主要用于脱盐与缓冲液的置换，是非常经典的一款凝胶过滤填料。

Sephadex系列预装柱有HiTrap和HiPrep两种，都属于无法拆卸的柱型，HiTrap柱型的填料耐压0.3 MPa而柱管耐压0.5 MPa，HiPrep柱型的填料耐压0.15 MPa而柱管耐压0.5 MPa。

Sephadex系列脱盐柱的清洗建议用0.2 M NaOH反向冲洗2个CV，而后用2-3个CV的缓冲液冲洗直至pH回调至中性。

02 Sepharose

Sepharose是传统的偶联琼脂糖填料，非特异性吸附性低，回收率高。Sepharose具有非常宽阔的分离范围，适合分离分子量大小差异大并对分辨率要求不高的样本。

Sepharose系列预装柱的清洗建议用0.5 M NaOH清洗1-1.5CV，再用1-2 CV的水清洗，然后用1-2 CV的水溶液平衡。为了去除结合能力强的杂质，可以考虑用非离子型去污剂清洗2 CV，再用至少2-3 CV的水溶液清洗。

03 Sephacryl

Sephacryl，葡聚糖交联N,N’-亚甲基二乙酰胺，经济，高效，具有多种不同分离范围的产品，提供了广阔的选择性。它不仅可以分离一般蛋白，也可以用于分离蛋白多糖、质粒、甚至较大的病毒颗粒。

Sephacryl系列的预装柱有两个柱型：HiPrep 16/600（柱体积120 mL）以及HiPrep 26/600（柱体积320 mL），平均颗粒粒径为47 um，柱两端压力差不能超过0.15 MPa（填料耐压），而柱前压不能超过0.5 MPa（柱管耐压）。

需要特别提醒的是，HiPrep Sephacryl预装柱无法拆卸，无法更换滤膜，且Sephacryl填料的耐压相对较低，因此需要格外注意分子筛的日常使用情况，一旦堵了处理起来较为棘手。层析柱出现压力升高时就需要用NaOH冲洗，用0.2 M NaOH反向冲洗0.5个CV，再用至少2个CV的缓冲液平衡。当层析柱堵塞较为严重时，可以用0.5 M NaOH反向冲洗1/4个CV再用4个CV的纯水冲洗，再次使用前用至少5 CV的缓冲液平衡。由于Sephacryl填料的pH短时耐受为2-13，因此不建议使用1 M NaOH。

一旦出现低流速运行（例如0.1 mL/min）也会超压的情况，建议正向进样10 mL 0.5 M NaOH后暂停流速浸泡柱头顶端部位一段时间，再用纯水将NaOH反向冲出，如此循环用NaOH浸泡柱头数次观察清洗效果。该方法对于可以更换滤膜的其它层析柱同样可行。

04 Superdex/Superose pg

Superdex/Superose pg系列填料由高度交联琼脂糖构成，具有很高的分辨率/分离范围，能够一次性分离生物大分子大小差异大的混合物。填料本身刚性好、颗粒细小并且大小分布集中，所以允许高流速的纯化工作，在中、高压层析系统当中均有良好的使用效果。

Superdex/Superose pg系列的预装柱有两个柱型：HiLoad 16/600（柱体积120 mL）以及HiLoad 26/600（柱体积320 mL），使用XK系列空柱装填，pg（prep grade，制备级）系列填料的平均颗粒粒径为34 um，柱两端压力差不能超过0.3 MPa（填料耐压），而柱前压不能超过0.5 MPa（柱管耐压）。

Superdex/Superose pg系列填料的CIP pH稳定性为1-14，Z高可以耐受1 M NaOH，当出现超压现象时，建议0.5 M NaOH反向冲洗0.5-1个CV，再用至少2个CV的缓冲液进行平衡。同时，NaOH清洗效果不佳时可以考虑更换层析柱的顶端滤膜（滤膜货号18876101针对于HiLoad 16/600柱型，滤膜货号18876001针对于HiLoad 26/600柱型）。

该系列层析柱有单独的散装填料和空柱，可以自行装填但耗时耗力。

05 Superdex/Superose Increase

Superdex/Superose Increase系列是平均颗粒粒径小于10 μm的超高分辨率分子筛预装柱，除3.2/300柱型外均使用Tricorn系列空柱装填（无散装填料，不建议自行装柱）。柱两端压力差不能超过3 MPa（填料耐压），而柱前压不能超过5 MPa（柱管耐压），较为特殊的是5/150 GL柱型的柱管耐压为10 MPa，而3.2/300柱型的填料耐压为2 MPa。

Increase系列填料的CIP pH稳定性为1-14，Z高可以耐受1 M NaOH，当出现超压现象时建议的处理方法是：对层析柱进行反向清洁，将杂质直接冲到管路中，用0.5-1 M NaOH反冲1个柱体积 (Column Volume, CV) ，紧接着用1个CV的纯水将碱冲出，然后用至少2个CV的缓冲液冲洗直至pH回调至中性。

如果冲洗效果不佳，可以尝试强力清洗：使用含2 M NaCl的30%异丙醇反向冲洗2个CV，紧接着用1-2个CV的纯水冲洗，然后用1M NaOH反向冲洗1.5个CV，流速过低时还可以保持静止30 min，使NaOH充分润洗预装柱，Z后用至少2个CV的缓冲液冲洗直至pH回调至中性。

如果正向清洗，容易将杂质冲到整根柱管里面。值得注意的是，需要先观察顶端滤膜是否有歪斜，如果滤膜出现歪斜，反冲有可能把填料冲出柱子外，此时是需要避免反冲的。

当层析柱用NaOH清洗后压力没有明显下降或者观察到顶端滤膜发黄时，说明滤膜上有不少杂质沉积，此时压力较高的原因可能主要来源于滤膜而非填料，建议更换新滤膜（滤膜货号29053612 Tricorn 10 Filter Kit针对于10/300 GL柱型，滤膜货号29053586 Tricorn 5 Filter Kit针对于5/150 GL柱型，而3.2/300柱型无法拆卸，无法更换滤膜），或者也可以取出原有滤膜，超声泡碱清洗20-30 mins后放回继续使用。滤膜取出前，注意用Marker笔标注原有的胶面位置。滤膜放回时，注意避免引入气泡。