mRNA药物的关键递送载体

有效的体内递送是mRNA疫苗（药物）实现治疗 效果的关键性要素。外源mRNA必须穿透脂质膜的屏障，才能进入细胞质，进而被成功翻译成功能性蛋白质。将mRNA递送到细胞内部共有两道障碍，递送途中的酶降解和静电排斥致使的膜屏障。理想的递送系统需要满足以下几个条件：在到达靶点之前要有效地包裹和保护mRNA以维持其稳定；帮助 mRNA 高效地进入细胞；在 mRNA到达溶酶体之前及时地将其释放到细胞质中。

mRNA疫苗的递送
图片来源于Biotechnology Advances

目前，已经开发了多种递送载体用于促进mRNA疫苗（药物）的细胞摄取并保护其免于降解。主要的非病毒载体有鱼精蛋白、脂质体、树突细胞、无机纳米粒子等。其中，脂质体能够形成球形囊泡，将 mRNA 包裹在内，抵御核酸酶的作用；易与受体细胞融合，转染效率高；可递送不同大小片段的 mRNA；作为递送载体不受宿主限制等优点，成为递送mRNAZ有效的非病毒载体。

mRNA的递送载体

图片来源于Biotechnology Advances

随着两款mRNA疫苗获批，脂质纳米颗粒(Lipid Nanoparticles，LNPs)载体成了mRNA疫苗Z常用的载体之一。LNP主要由可电离阳离子脂质、胆固醇、中性辅助磷脂和聚乙二醇修饰的磷脂（PEG-脂质）组成。阳离子脂质是在酸性pH条件下，可离子化成带有正电荷脂质，因此能够在酸性缓冲液中将它和mRNA组成复合物，但是在生理条件pH条件下，它呈现中性，从而能够减少毒性。PEG脂质的疏水端与阳离子脂质的疏水端结合，其PEG亲水端则在水溶液里形成纳米颗粒的Z外层，其比例决定了纳米颗粒的大小。胆固醇是为了增加核酸脂质纳米粒的稳定性，使PEG-脂质的疏水端与阳离子脂质的疏水端结合更为紧密。而中性辅助磷脂能够促进LNP和细胞膜以及内吞体膜的结合，促进细胞摄取和内吞体逃逸。

核酸脂质纳米粒各成分及其作用示意图

目前mRNA和脂质的混合是通过微流控系统来完成的，微流控过程工艺参数需要考虑总流速、压力、流速比例、芯片内部结构、温度等条件。丹纳赫生命科学旗下PNI（Precision NanoSystems Inc.）的纳米药物制备系统可以在几分钟甚至几秒内完成纳米颗粒的小试制备。将核酸与脂质分别溶解在水相和有机相后，纳米药物制备系统推动两相溶液通过特制芯片通道，完成纳米颗粒的合成。

PNI的NxGen 的层流混合技术可以确保形成均一、可控和可重复的纳米颗粒。

NxGen 混合技术

且PNI拥有一系列不同规格的微流控系统，可以满足用户从研发到GMP生产的各类需求。

PNI的微流控系统

外泌体是细胞分泌到胞外的一种囊泡（Extracellular Vesicles，EVs），其大小为30-150nm，具有双层膜结构，内含丰富的核酸、蛋白、脂质等，参与细胞间的分子传递。在众多的mRNA递送载体技术中，外泌体作为一种内源性的纳米载体，有着其它药物载体难以企及的优势：

➤ 体积小且结构稳定；

➤ 其组成与自体细胞成分高度相似，具有天然的非免疫原性；

➤ 表面的蛋白成分也决定了其卓 越的识别靶细胞的特性，甚至能帮助其包载的药物跨过血脑屏障。

随着mRNA技术越来越多地应用于肿瘤、罕见病等疾病药物的研发，外泌体作为mRNA药物的递送载体也成为很多mRNA研发人员关注的重 点。

外泌体的主要结构特征

图片来源于Science.2020 Feb 7;367(6478):eaau6977.

2019年，来自美国俄亥俄州立大学的L. James Lee教授、梅奥医学中心的Betty Y. S. Kim教授、中国吉林大学的滕乐生教授合作在Nature Biomedical Engineering杂志上发表文章，报道了大量产生携带功能mRNA的外泌体用于疾病治疗的方法。近日，一家基于人工智能的RNA精 准医疗的中国公司NeoCura和一家基于细胞外囊泡药物递送平台的韩国公司MDimune Inc达成合作协议，共同开发基于外泌体递送癌症疫苗的mRNA治疗。在这项合作中，MDimune将利用CDV（细胞衍生囊泡）工程包装目标mRNA，并初步证明功效。

由于外泌体是来源于细胞质膜内陷的含有脂质双分子层膜结构的多泡体，存在于胞外基质。为了获得高纯度的外泌体，必须保证有效去除所有的细胞碎片及其它不需要的膜结构，才能确保后续实验的顺利进行。目前，从生物体液中分离外泌体的各种方法已经被开发出来，主要根据外泌体的大小、密度、免疫特性等特点进行操作。差速超速离心是外泌体分离方法中公认的“金标准”，也是高分文章中首 选的分离方法。

贝克曼库尔特生命科学提供成熟的外泌体纯化方案：首先可采用差速离心法，主要是采用低速离心去除死细胞、大的细胞碎片；高速离心去除小的细胞碎片、细胞器及大囊泡等；Z 后用超速离心得到大小相近的囊泡颗粒。

差速离心法分离外泌体步骤

如果对于外泌体的纯度要求高，可采用等密度梯度离心法对外泌体进行纯化。主要原理是在超速离心力作用下，通过预先铺设蔗糖溶液或碘克沙醇不连续密度液或连续密度梯度液，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/mL的密度范围富集。

等密度梯度离心精纯外泌体步骤

形态学观察是进行物质检测Z直接和直观的手段，由于外泌体体积小，需要高分辨的成像设备进行检测，徕卡显微系统拥有从静态到动态以及机理研究的一系列外泌体成像方案。

透射电子显微镜的分辨率可达0.1-0.2nm，非常适合进行外泌体双层囊膜超微结构观测。徕卡显微系统拥有高真空镀膜仪，可用于外泌体的负染载网亲水化，帮助更好地进行外泌体透射电镜的观察。

外泌体透射电镜的负染法观察

同时，徕卡显微系统活细胞光电联用方案还能将脂质体、外泌体与细胞的动态生理关系与瞬时生理过程的超微结构同时呈现出来。该方案是在光镜水平活体观测到的脂质体、外泌体与细胞膜融合或分离的动态过程在特定时间点，通过高压冷冻迅速固定样品，再经过冷冻替代、树脂聚合、超薄切片，Z 后到透射电镜下进行观察。

Leica 活细胞光电联用技术解决方案

徕卡显微系统还拥有扫描电镜的前处理方案，可以丰富研究者的观察维度。

外泌体扫描电镜的观察

另外，徕卡STED技术由于其分辨率高（横轴可达30nm分辨率）、速度快（可实现视频级成像）、成像深度大（可达100 µm以上） ，而被众多科学家用于外泌体研究，如可检测四种跨膜蛋白可能的分布，深入了解囊泡运输中motor的异质。

STED拍摄的不同种类的囊泡运输相关蛋白的定位信息

图片来源于Science 320.5873(2008):246-249.

利用STED技术研究关于外泌囊泡两个相关蛋白的位置信息。

图中，B和D为共聚焦图片，A、C、E为STED拍摄的图片。利用STED技术得到囊泡上蛋白质的分布信息，及两种关键蛋白的位置信息，判定共定位，而佐证是否互作。

图片来源于PLoS ONE 9.5(2014):e97692

Leica STELLARIS 8 STED超高分辨率显微镜

STELLARIS STED在低激光强度下实现超高分辨成像效果

基因治疗技术快速发展，脂质体、外泌体等递送载体也用于寡核苷酸、基因编辑等基因治疗产品中，丹纳赫生命科学能够提供多种药物载体从制备到检测的多元化研究方案。