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壳聚糖纳米粒用于基因递送载体的研究

来源：威尼德生物科技(北京)有限公司      分类：科技文献 2024-11-19 18:21:04 37阅读次数
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一、引言


基因治疗旨在通过将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿缺陷和异常基因引起的疾病。然而，基因治疗的成功在很大程度上依赖于合适的基因递送载体。理想的基因递送载体应具备以下特点：高基因转染效率、良好的生物相容性、低免疫原性、能够保护基因免受核酸酶降解、易于制备和修饰以及具有靶向性等。


目前，病毒载体和非病毒载体是基因递送的两大主要类型。病毒载体具有高转染效率，但存在免疫原性、潜在的致瘤性以及制备和质量控制复杂等问题。相比之下，非病毒载体，如脂质体、聚合物纳米粒等，具有安全性高、易于大规模生产等优点。壳聚糖纳米粒作为一种新型的非病毒基因递送载体，近年来受到了广泛的关注。壳聚糖是一种天然的阳离子多糖，来源丰富，具有良好的生物可降解性和生物相容性，其独特的聚阳离子性质使其能够与带负电的核酸通过静电相互作用形成纳米复合物，从而有效地压缩和保护基因，并促进基因的细胞摄取。

二、壳聚糖的性质

（一）化学结构


壳聚糖是由甲壳素脱乙酰化得到的，其化学结构由 β-(1 - 4) 连接的 D - 葡萄糖胺和 N - 乙酰 - D - 葡萄糖胺组成。脱乙酰度是壳聚糖的一个重要参数，它影响着壳聚糖的溶解性、电荷密度等性质。较高的脱乙酰度通常意味着更多的氨基暴露，从而使壳聚糖具有更强的阳离子性质。

（二）物理性质


壳聚糖在酸性溶液中具有良好的溶解性，这是由于氨基的质子化作用。其溶液具有一定的粘性，粘性大小与壳聚糖的分子量和浓度有关。此外，壳聚糖可以形成多种形态的材料，如薄膜、凝胶和纳米粒等，这为其在不同领域的应用提供了基础。

（三）生物性质


壳聚糖具有良好的生物相容性，在体内可被溶菌酶等酶类降解为无毒的低聚糖和单糖。它还具有一定的抗菌性、止血性和促进伤口愈合等生物活性，这些性质使得壳聚糖在生物医学领域具有广泛的应用前景。同时，壳聚糖与生物膜的相互作用较弱，不易引起细胞膜的破坏，减少了对细胞的损伤。

三、壳聚糖纳米粒的制备方法

（一）离子凝胶化法


这是制备壳聚糖纳米粒最常用的方法之一。将壳聚糖溶解在酸性溶液中，然后将其与带负电的聚阴离子（如三聚磷酸钠，TPP）溶液混合。通过静电相互作用，壳聚糖与聚阴离子发生交联，形成纳米粒。反应条件如壳聚糖和聚阴离子的浓度、溶液的 pH 值、离子强度等对纳米粒的粒径、表面电荷和稳定性有显著影响。例如，增加壳聚糖的浓度通常会导致纳米粒粒径增大，而适当调整 pH 值可以优化纳米粒的形成和稳定性。

（二）乳化 - 溶剂挥发法


首先将壳聚糖溶解在有机溶剂中，然后将其与含有基因的水溶液混合，通过乳化形成油包水型乳液。接着，通过蒸发有机溶剂使壳聚糖在水相中沉淀形成纳米粒。这种方法可以有效控制纳米粒的粒径和包封率，但需要注意有机溶剂残留对生物安全性的影响。在实验中，可以通过优化乳化剂的种类和用量、有机溶剂的选择以及蒸发条件等来提高纳米粒的质量。

（三）聚电解质复合凝聚法


将壳聚糖溶液与含有基因和另一种聚电解质的溶液混合，在一定条件下，由于聚电解质之间的静电相互作用和复合物的相分离，形成壳聚糖纳米粒。通过选择不同的聚电解质和调整反应条件，可以调控纳米粒的性质。例如，使用不同分子量和电荷密度的聚电解质可以改变纳米粒的粒径和表面电荷。

四、壳聚糖纳米粒在基因递送中的优势

（一）保护基因免受降解


壳聚糖纳米粒能够通过静电相互作用将基因紧密包裹在内部，形成稳定的复合物。这种复合物可以有效保护基因免受核酸酶的降解，提高基因在体内外环境中的稳定性。在体外实验中，将包裹基因的壳聚糖纳米粒与核酸酶共同孵育，通过凝胶电泳等方法可以观察到基因的完整性得到了很好的保护。

（二）提高细胞摄取效率


壳聚糖纳米粒表面的正电荷使其能够与细胞膜表面的负电荷相互吸引，从而促进纳米粒通过内吞作用进入细胞。此外，通过对壳聚糖纳米粒进行表面修饰，如连接细胞穿透肽等，可以进一步提高细胞摄取效率。在细胞摄取实验中，使用荧光标记的基因和壳聚糖纳米粒，通过荧光显微镜或流式细胞术可以观察到纳米粒在细胞内的摄取情况。

（三）生物相容性和安全性


壳聚糖本身的生物相容性良好，其形成的纳米粒在体内不会引起明显的免疫反应。与病毒载体相比，壳聚糖纳米粒没有病毒基因组整合到宿主细胞基因组的风险，大大提高了基因治疗的安全性。在动物体内实验中，将壳聚糖纳米粒经不同途径给药后，通过组织病理学检查和血液生化指标分析等方法，可以评估其生物相容性。

（四）可修饰性


壳聚糖纳米粒可以通过化学修饰在其表面连接各种功能分子，如靶向配体、成像基团等。靶向配体可以使纳米粒特异性地识别并结合靶细胞表面的受体，实现基因的靶向递送，提高治疗效果并减少对正常组织的副作用。成像基团则可以用于监测纳米粒在体内的分布和转移动态。例如，将叶酸连接到壳聚糖纳米粒表面，可以使纳米粒靶向叶酸受体高表达的肿瘤细胞。

五、壳聚糖纳米粒用于基因递送的实验研究

（一）体外实验


  1. 细胞培养
    选择合适的细胞系进行实验，如肿瘤细胞系（如 HeLa 细胞、A549 细胞等）和正常细胞系（如 NIH3T3 细胞等）。将细胞培养在含有适当培养基、血清和抗生素的培养瓶中，在 37°C、5% CO₂的培养箱中培养至对数生长期，用于后续实验。

  2. 纳米粒的制备与表征
    按照上述制备方法制备壳聚糖纳米粒，通过动态光散射（DLS）测量纳米粒的粒径和粒径分布，利用 zeta 电位仪测定纳米粒的表面电荷。通过透射电子显微镜（TEM）观察纳米粒的形态。同时，采用高效液相色谱（HPLC）或其他方法测定纳米粒对基因的包封率和载药量。

  3. 细胞摄取实验
    将荧光标记的基因 - 壳聚糖纳米粒复合物与细胞共同孵育一定时间（如 2 - 4 小时），然后用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤细胞，去除未结合的纳米粒。通过荧光显微镜观察细胞内的荧光信号，或者使用流式细胞术定量分析细胞摄取纳米粒的比例。同时，可以研究不同因素（如纳米粒的粒径、表面电荷、修饰情况等）对细胞摄取的影响。

  4. 基因转染效率评价
    将含有报告基因（如绿色荧光蛋白基因，GFP）的壳聚糖纳米粒复合物与细胞孵育一定时间后，通过荧光显微镜观察 GFP 的表达情况，或者使用荧光酶标仪定量测定 GFP 的荧光强度，以评估基因转染效率。同时，对比不同制备条件下的纳米粒以及与其他基因递送载体的转染效率。

（二）体内实验


  1. 动物模型建立
    根据研究目的选择合适的动物模型，如建立肿瘤模型可以通过皮下注射肿瘤细胞或原位接种肿瘤细胞等方法。对于基因治疗相关疾病模型，可以通过基因编辑技术或诱导特定基因缺陷等方式建立。例如，对于某些遗传性疾病模型，可以通过基因敲除或敲入技术在小鼠等动物上构建模型。

  2. 给药途径和剂量确定
    选择合适的给药途径，如静脉注射、瘤内注射、口服等。通过前期的预实验确定合适的纳米粒给药剂量。在静脉注射时，要考虑纳米粒的粒径和表面性质对其在体内分布的影响，避免被单核巨噬细胞系统快速清除。对于瘤内注射，要注意注射的准确性和对肿瘤组织的影响。

  3. 基因表达监测和治疗效果评估
    在给药后不同时间点，采集组织样本（如肿瘤组织、靶器官组织等），通过实时定量聚合酶链反应（qPCR）检测基因的表达水平，或者使用免疫组织化学方法观察基因表达产物的分布情况。同时，根据疾病模型的特点，评估治疗效果，如对于肿瘤模型，可以观察肿瘤体积的变化、动物生存期等；对于遗传性疾病模型，可以检测相关生理指标的改善情况。

  4. 生物安全性评价
    在整个实验过程中，要对动物的体重、饮食、血液生化指标、组织病理学变化等进行监测，评估壳聚糖纳米粒在体内的生物安全性。观察是否有炎症反应、免疫激活、器官损伤等不良反应。

六、壳聚糖纳米粒作为基因递送载体面临的挑战

（一）转染效率仍需提高


尽管壳聚糖纳米粒具有一定的基因转染能力，但与病毒载体相比，其转染效率仍相对较低。这可能是由于在细胞内体逃逸过程中存在障碍，导致基因不能有效释放到细胞质或细胞核中。需要进一步研究如何优化纳米粒的结构和组成，以提高内体逃逸效率。

（二）体内靶向性的精准控制


虽然可以通过表面修饰实现一定的靶向性，但在复杂的体内环境中，要实现精准的靶向递送仍然具有挑战性。需要开发更特异性、更高效的靶向配体，并深入研究体内的生理病理环境对纳米粒靶向的影响。

（三）大规模生产和质量控制


在将壳聚糖纳米粒用于临床基因治疗时，需要建立稳定的大规模生产工艺，并确保产品的质量一致性。目前，制备过程中的一些参数（如粒径、表面电荷等）的稳定性控制还存在一定困难，需要进一步优化生产工艺和质量控制方法。

七、结论


壳聚糖纳米粒作为一种有前途的基因递送载体，在基因治疗领域展现出了独特的优势。通过深入研究壳聚糖的性质、优化纳米粒的制备方法、提高基因转染效率和靶向性以及解决大规模生产和质量控制等问题，有望进一步推动壳聚糖纳米粒在基因治疗中的临床应用，为基因相关疾病的治疗提供更安全、有效的解决方案。未来的研究需要多学科的交叉合作，从材料科学、生物医学工程、分子生物学等多个角度深入探索，以充分发挥壳聚糖纳米粒在基因递送领域的潜力。


标签：紫外交联仪原位杂交仪分子杂交仪

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