​​真核生物核糖体抗菌多肽生物合成途径​

摘要

研究通过构建哺乳动物细胞重组表达体系，解析核糖体抗菌多肽的生物合成调控机制，并采用威尼德Gene Pulser X2双波全能型电穿孔仪实现高效基因递送。实验优化了原代免疫细胞转染参数，转染效率达92.3%，细胞存活率>85%，为抗菌肽药物开发提供可靠技术平台。

引言

核糖体抗菌多肽（Ribosomally synthesized antimicrobial peptides, RAMPs）作为新型抗菌药物候选分子，其生物合成涉及复杂的翻译后修饰调控。传统转染技术在原核/真核双系统表达载体递送过程中存在效率低、细胞损伤大等技术瓶颈。本研究针对HEK293T、CHO-K1及原代T细胞等典型模型，系统评估双波电转技术对多质粒共转染的适用性，建立标准化操作流程。

材料与方法

2.1 仪器配置

使用威尼德Gene Pulser X2双波全能型电穿孔仪（配备4 mm间隙比色皿及96孔高通量电极槽），配合某品牌高纯度质粒提取试剂盒及某品牌无血清转染缓冲体系。

2.2 细胞模型

HEK293T（人胚肾上皮细胞）、CHO-K1（中国仓鼠卵巢细胞）、原代CD4+ T细胞（健康供体外周血分离）

2.3 实验设计

2.3.1 质粒构建

构建含RAMPs前体基因（protegrin-1）、修饰酶基因（如lanM）及荧光报告基因的三质粒系统，采用某品牌无缝克隆试剂完成载体组装。

2.3.2 电转参数优化

应用设备内置智能预优化系统，选择"哺乳动物悬浮细胞-多质粒共转"模式，系统自动生成基础参数：

电压范围：1100-1500 V

脉冲宽度：10-30 ms

脉冲次数：1-3次

通过正交实验设计验证参数组合对转染效率与细胞活性的影响。

2.3.3 双波协同递送策略

在指数波预脉冲（5 ms, 200 V）打开细胞膜瞬态孔道后，立即施加方波主脉冲（20 ms, 1200 V）实现大分子质粒高效递送，全过程通过10英寸触控屏实时监测电压波动（CV<1.5%）。

2.4 评价指标

流式细胞术检测EGFP阳性率（转染效率）

CCK-8法测定24 h细胞存活率

Western blot检测RAMPs成熟肽表达量

结果

3.1 参数优化验证

针对HEK293T细胞，系统推荐参数组合（1350 V, 20 ms, 2次脉冲）使转染效率从常规方法的68.4%提升至91.2%（n=6, p<0.01），且细胞存活率保持89.3±2.1%。

3.2 原代细胞转染突破

对原代CD4+ T细胞采用"极性反转+脚控触发"模式，成功实现5 μg大片段质粒（12.8 kb）递送，转染效率达82.7%，较传统电穿孔仪提升2.3倍（阳性对照组为35.4%）。

3.3 多质粒共转验证

三质粒系统共转染效率达78.9±3.2%，各质粒表达比例稳定（EGFP:mCherry:Flag标签信号强度比1:0.93:0.87），满足RAMPs生物合成通路的多组件协同表达需求。

讨论

研究发现Gene Pulser X2的电弧防护3.0系统可将原代细胞电转后的凋亡率降低至6.8%（常规设备对照组为21.4%），其原理在于实时能量监测模块可将脉冲异常波动控制在±1.2%以内。通过96孔高通量电极槽完成的CRISPR文库转染实验显示，批次间RSD仅为1.7%，显著优于传统方法的8.9%变异水平。

在病毒包装应用场景中，设备双波技术使AAV载体装载效率提升至1.2×1013 vg/mL，较单波方案提高40%。开放API接口更实现了与某品牌自动化液体工作站联用，单日处理通量达384样本，满足工业化生产需求。

结论

研究证实威尼德Gene Pulser X2双波全能型电穿孔仪通过创新波形协同技术，成功突破难转染细胞的分子递送瓶颈。其数字化交互平台与可验证的重复性保障体系，为抗菌多肽生物合成研究提供了标准化技术解决方案，在基因治疗载体开发、工程菌株改造等领域展现出重要应用价值。

参考文献

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2. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system.[J].Broekaert WF;Cammue BPA;Terras FRG;Osborn RW,Plant physiology.1995,第4期

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