Vaccinia Capping System

产品简介

真核生物中mRNA经转录后修饰可在5'端形成一个特殊结构，即帽子结构，该结构对mRNA的稳定、转运与翻译过程均有较重要作用。牛痘病毒加帽酶是催化形成帽子结构的有效酶，其由D1和D12两个亚基组成，兼具RNA三磷酸酯酶活性（TPase）、鸟苷酰基转移酶活性（GTase）和鸟嘌呤甲基转移酶活性（N7 MTase）。牛痘病毒加帽酶参与作用下的mRNA加帽过程如下图1所示，在mRNA 5'端添加一个7-甲基鸟嘌呤帽结构（m7Gppp），即为Cap0（图2）。

mRNA +1位核苷酸的核糖2’位羟基也可以甲基化，产物称为Cap1，人类的mRNA都具有Cap1结构。Cap1不仅与翻译起始有关，在针对外源RNA的先天免疫系统中，还可作为自身RNA的标志。2-O-甲基转移酶可以在mRNA +1位核苷酸的2´-OH位置处添加一个甲基基团，最终形成最有Cap1结构的mRNA（图3）。

该产品主要应用于RNA体外转录之后加帽，形成具有Cap1帽子结构的mRNA。

图1 Cap0的形成过程

图2 带有Cap0结构的mRNA

图3 带有Cap1结构的mRNA

产品信息

组分信息

用户需自备材料：转录后的RNA、RNA纯化试剂。

备注：RNA 可使用翌圣生物10623ES（T7 High Yield RNA Synthesis Kit）进行合成。

储存条件

-25~-15℃保存，有效期1年。

使用说明

酶法加帽反应（以20μl 反应体系为例）:

1) 取10μg RNA用 DEPC-H₂O 稀释至14 μL；

2) 将 RNA 置于 65℃加热 5min，而后立即置于冰上 5min；

3) 依次加入以下各组分：

37℃反应30min。

注意事项

1. 加帽效率受RNA 5’端序列及结构影响，因此建议在加帽反应前，通过热变性的方法打开RNA的二级结构使RNA更容易加帽。一般热变性的操作条件为65℃、5min后立即置于冰浴，但可根据5’端序列、结构的复杂程度以及加帽体积适当延长热变性时间；
2. 本试剂盒中SAM浓度为32mM，如加样体积过小，可在加帽反应前根据使用量将32mM储液用DEPC-H₂O稀释成8mM或更低浓度的工作液；因SAM不稳定，稀释过程需在冰上操作，稀释量应等同于使用量；不建议将储液一次性稀释成低浓度的工作液;
3. 如仅需要制备具有Cap0帽子结构的RNA，反应体系中可不添加2-O-methyltransferase；
4. 加帽反应一般可在30min之内完成，可根据RNA 5’端序列、长度以及反应体积等调整时长。
5. 本产品仅作科研用途。
6. 为了您的安全和健康，请穿实验服并佩戴一次性手套操作。

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Ver.CN20231130