Hieff NGS^® OnePot Pro DNA Library Prep Kit V2 是一款可用于Illumina^®和MGI^®高通量测序平台的新一代酶切法建库试剂盒。与传统的建库法比较，本品采用高质量的片段化酶，摆脱了繁琐的超声过程，同时简化了操作流程，将片段化模块与末端修复模块合二为一，极大的降低了建库的时间和成本。本试剂盒具有优秀的文库转化率，可应用于常规动植物基因组、微生物基因组等样本，同时能兼容FFPE DNA样本的建库。在前一代建库试剂盒的基础上，改进了片段化/末修/加A模块，降低了试剂对样本的GC偏好性，提高了末修/加A的效率和试剂的稳定性；本试剂盒使用了最新优化的连接酶，改善了接头连接效率。同时，本试剂盒可搭配Illumina^®或MGI^®的接头和Primer，用于Illumina^®和MGI^®高通量测序平台测序。

• 适用100 pg - 1 μg的基因组DNA、全长cDNA等样本
• 高质量片段化酶，可随机切割双链DNA，酶切片段偏好性低
• 片段化、末端修复/加A一步完成
• 强扩增效率的高保真酶，显著提高文库质量及产量
• 适用于FFPE DNA样本
• 严格的批次性能与稳定性质控

 

产品组分

组分编号		组分名称	产品编号/规格
			12195ES08		12195ES24	12195ES96
12195-A		Smearase® Buffer 2.0		80 μL	240 μL	960 μL
12195-B		Smearase® Enzyme 2.0		80 μL	240 μL	960 μL
12195-C		Ligation Enhancer 2.0		240 μL	720 μL	3×960 μL
12195-D		Rapid DNA Ligase 2.0		40 μL	120 μL	480 μL
12195-E		Canace® Pro Amplification Mix		200 μL	600 μL	3×800 μL

注：本试剂盒组分兼容Illumina和MGI双平台，如果适配完整接头，需要额外配置专属于Illumina^®或者MGI^®的primer mix(Cat#12190 Hieff NGS^® DNA Library Prep Primer Mix for Illumina^®或Cat#12191 Hieff NGS^® DNA Library Prep Primer Mix for MGI^®)。

 

运输与保存方法

干冰运输。-25~-15 °C保存，有效期1年。

 

注意事项

一、关于操作

1. 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

2. 请于使用前将试剂盒各组分置于室温解冻。解冻后上下颠倒数次充分混匀，短暂离心后置于冰上待用。

3. 配制各步骤反应液时推荐使用移液器吹打混匀或轻轻振荡，剧烈振荡可能会造成文库产出下降。

4. 为避免样品交叉污染，推荐使用带滤芯的枪头，吸取不同样品时请更换枪头。

5. 推荐在带热盖的PCR仪中进行各步骤反应，使用前应预热PCR仪至反应温度附近。

6. PCR产物因操作不当极容易产生气溶胶污染，进而影响实验结果准确性。推荐将PCR反应体系配制区和PCR产物纯化检测区进行强制性的物理隔离；使用专用的移液器等设备；并定时对各实验区域进行清洁（使用0.5%次氯酸钠或10%漂白剂进行擦拭清理），以保证实验环境的洁净度。

7. 本产品仅作科研用途！

二、关于DNA片段化

1. 本试剂盒兼容范围为100 pg - 1 μg Input DNA。应尽可能使用A₂₆₀/A₂₈₀ = 1.8-2.0的高质量Input DNA。

2. 若Input DNA中引入高浓度金属离子螯合剂或其他盐，可能会影响后续实验，建议将DNA稀释在ddH₂O中进行片段化。

3. 对于常规的高质量基因组DNA，酶切时间参考表7，本试剂盒片段化偏好性低，耐受各种GC含量的模板。表7为推荐时间，需客户在自己的实验体系中进行微调，以达到最佳效果。

4. 为保证优质精确的片段化效果，片段化反应配制过程请于冰上操作。

三、关于接头连接 (Adapter Ligation)

1. 针对Illumina^®测序平台，Yeasen可提供如下接头：

a. Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for Illumina®, Set 1~Set 2 (Cat#13519~Cat#13520)，试剂盒中的接头浓度为15 μM；

b. Hieff NGS^® 384 CDI Primer for Illumina^®(Cat#12412~Cat#12413)，试剂盒中的接头浓度为15 μM；

c. Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)，试剂盒中的接头浓度为15 μM；

d. Hieff NGS^® Dual UMI UDI Adapter Kit for Illumina^®，Set1~Set2 （Cat#13370~Cat#13371），试剂盒中的接头浓度为15 μM。

2.针对MGI^® 高通量测序平台，Yeasen可提供如下接头：

a.Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362），试剂盒中的接头浓度为10 μM；

b.Hieff NGS^® 384 CDI Primer for MGI^®，Set 1~Set 2（Cat#13363 ~ Cat#13364），试剂盒中的接头浓度为10 μM；

c.Hieff NGS^® Unique Dual Barcode Primer Kit for MGI^®，Set 1~Set 4 （Cat#13536 ~ Cat#13539），试剂盒中的接头浓度为10 μM；

d.Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 （Cat#13367~Cat#13368)，试剂盒中的接头浓度为10 μM。

3.Adapter的质量和使用浓度直接影响连接效率及文库产量。Adapter用量过高可能会产生较多Adapter Dimer；用量较低可能会影响连接效率及文库产量；使用Adapter时根据Input DNA量用TE Buffer进行相应稀释。 

表1列举了使用本试剂盒的不同Input DNA量推荐的针对Illumina^®测序平台常规和UMI Adapter的稀释方法。

表2列举了使用本试剂盒的不同Input DNA量推荐的针对MGI^®测序平台常规Adapter的稀释方法。

表3列举了使用本公司Hieff NGS^® Dual UMI UDB Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 2 (Cat#13367~Cat#13368)的不同Input DNA量推荐的UMI Adapter稀释方法。

表1  100 pg-1 μg Input DNA针对Illumina^®测序平台推荐的常规和UMI Adapter使用浓度

Input DNA	Adapter稀释倍数	浓度
0.1ng ~ 1 ng	150倍稀释	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	75倍稀释	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	15倍稀释	1 μM
25 ng ~ 100 ng	7.5倍稀释	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	3倍稀释	5 μM

表2  100 pg-1 μg Input DNA针对MGI^®测序平台推荐的常规Adapter使用浓度

Input DNA	Adapter稀释倍数	浓度
<1 ng	100倍稀释	0.1 μM
1 ng ~ 10 ng	50倍稀释	0.2 μM
10 ng ~ 25 ng	10倍稀释	1 μM
25 ng ~ 100 ng	5倍稀释	2 μM
100 ng ~ 1000 ng	2倍稀释	5 μM

表3  100 pg-1 μg Input DNA针对MGI^®测序平台推荐的UMI Adapter使用浓度

Input DNA	Adapter稀释倍数	浓度
5 ng ~ 25 ng	50倍稀释	0.2 μM
25 ng ~ 100 ng	10倍稀释	1 μM
100 ng ~ 1000 ng	4倍稀释	2.5 μM

四、关于磁珠纯化与分选 (Bead-based Clean Up and Size Selection)

1. DNA片段长度分选步骤可选择在末端修复/dA尾添加之前，或接头连接后，或文库扩增后进行。

2. 当Input DNA质量≥50 ng，您可选择在接头连接后分选；如Input DNA质量<50 ng，建议您在文库扩增后进行分选。

3. Ligation Enhancer中包含高浓度的PEG，会对双轮分选产生显著影响。因此，如在接头连接后进行长度分选，必须先进行纯化步骤，再进行双轮分选步骤；如在末端修复/dA尾添加之前或文库扩增后进行长度分选，可直接进行双轮磁珠分选步骤。

4. 磁珠使用前应先平衡至室温，否则会导致得率下降、分选效果不佳。

5. 磁珠每次使用前都应充分振荡混匀或使用移液器上下吹打充分混匀。

6. 转移上清时，请勿吸取磁珠，即使微量残留都将影响后续文库质量。

7. 磁珠漂洗使用的80%乙醇应现用现配，否则将影响回收效率。

8. 进行长度分选时，初始样品体积应尽量≥ 100 μL，不足时请用超纯水补齐。以防因样品体积太小导致移液误差增大。

9. 产物洗脱前应将磁珠置于室温干燥。干燥不充分容易造成无水乙醇残留影响后续反应；过分干燥又会导致磁珠开裂进而降低纯化得率。通常情况下，室温干燥3-5 min足以让磁珠充分干燥。

10. DNA纯化或长度分选产物如需保存，可使用TE Buffer洗脱，产物可于4 °C可保存1-2周，-20 °C可保存1个月。

五、关于文库扩增 (Library Amplification)

文库扩增步骤需要严格控制扩增循环数。循环数不足，将导致文库产量低；循环数过多，又将导致文库偏好性增加、重复度增加、嵌合产物增加、扩增突变积累等多种不良后果。表4列举了使用本试剂盒，获得1 μg文库的推荐循环数。

表4  100 pg-1 μg Input DNA获得1 μg产物扩增循环数推荐表

Input DNA	1 μg文库产量推荐PCR循环数
1000 ng	2 - 4
500 ng	2 - 4
250 ng	4 - 6
100 ng	5 - 7
50 ng	7 - 9
10 ng	9 - 11
5 ng	10 - 12
1 ng	12 - 15
100 pg	16 - 18

【注】：如果使用了不完整的接头，需要扩增至少2个循环，形成完整的接头。建库过程中若进行片段分选，扩增时请参照较高循环数扩增。

六、关于文库质检 (Library Quality Analysis)

1. 通常情况下，构建好的文库可通过长度分布检测和浓度检测来进行质量评价。

2. 文库浓度检测可使用：基于双链DNA荧光染料的方法，如Qubit^®、PicoGreen^®等；基于qPCR绝对定量的方法。

3. 文库浓度检测不可使用：基于光谱检测的方法，如NanoDrop^®等。

4. 推荐使用qPCR方法进行文库浓度检测：Qubit^®、PicoGreen^®等基于双链DNA荧光染料的浓度测定方法时，无法有效区分单端连接Adapter的产物、两端均未连接Adapter的产物以及其他不完整双链结构产物；qPCR绝对定量基于PCR扩增原理，仅定量样品中两端Adapter完整的文库（即可测序的文库），可排除单端或双端都不连接Adapter的不可测序文库干扰。

5. 文库长度分布检测，可通过Agilent Bioanalyzer 2100等基于毛细管电泳或微控流原理的设备进行检测。

 

自备材料

1. 纯化磁珠：Cat#12601，Hieff NGS^® DNA Selection Beads或Cat#A63880，AMPure XP Beads或其他等效产品。

2. DNA质控：Agilent Technologies 2100 Bioanalyzer或其他等效产品。

3. DNA Adapter：接头详细介绍信息参考上面注意事项中的第三部分“关于接头连接”。

4.DNA Primer Mix：Cat#12190，DNA Library Prep Primer Mix for Illumina^® 或Cat#12191，DNA Library Prep Primer Mix for MGI^®

5.其他材料：无水乙醇、灭菌超纯水、TE Buffer (10 mM Tris-HCl，pH 8.0-8.5+1 mM EDTA)、低吸附EP管、PCR管、磁力架、PCR仪等。

 

操作流程

图1 OnePot Pro DNA建库试剂盒操作流程

 

实验实例

1. 不同片段化时间得到的插入片段大小

以500 ng 常规gDNA为模板，使用本试剂盒构建文库，片段化条件分别为37℃ 5/10/ 15/20/30 min，片段化产物1.2×磁珠纯化，21 μL ddH₂O洗脱，Qubit测定浓度后，稀释至2 ng/μL跑Qsep，回收的插入片段分布如下图所示。

      图2 不同片段化时间酶切片段分布图

2.不同片段化时间建库实验

以100 ng 常规gDNA为模板，使用本试剂盒构建文库，片段化条件分别为37℃ 5/10/ 15/20/30 min，PCR扩增6个循环，最终文库分布如下图所示。使用接头为Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)。

图3 不同片段化时间文库分布图

3.不同投入量建库实验

以常规gDNA为模板，投入量从100 pg ~ 1 μg，循环数从14 ~ 4个不等，使用本试剂盒构建文库，统一酶切15 min，100 pg投入量的gDNA建库产量可达到600 ng以上，且文库大小均一如下图。使用接头为Hieff NGS^® Complete Adapter Kit for MGI^®，Set 1~Set 3（Cat#13360 ~ Cat#13362）。

图4 不同投入量建库结果

4.不同物种建库实验

以常见动植物样本gDNA为模板，统一100 ng投入量酶切15 min使用本试剂盒构建文库，在相同的建库条件下得到的文库大小均一如下图。使用接头为Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)。

图5不同物种建库结果

5.不同质量度的FFPE样本建库

本试剂盒可以做到不同质量度的FFPE样本相同酶切时间，得到的文库大小一致。一般FFPE样本酶切15 min可以得到主峰在300 bp左右的文库，如果要文库主峰在300 ~ 400 bp，可酶切8 min，然后在连接后进行双轮分选，分选比例为0.65×；0.2×。

以低中高不同质量度的FFPE样本为模板，50 ng投入量使用本试剂盒构建文库，酶切15 min建库，得到的文库大小均一如下图。使用接头为Hieff NGS^® Stubby UDI Primer Kit for Illumina^® (Cat#12404~Cat#12407)。

图6 不同质量度FFPE样本建库结果