FITC 异硫氰酸荧光素 | CAS 3326-32-7

FITC，英文全称Fluorescein Isothiocyanate，中文名称异硫氰酸荧光素，具有高吸收率、优良的荧光量子产率和良好的水溶性等特点，是生物学中应用最为广泛的一种绿色荧光素衍生物，其异硫氰酸基团可与蛋白的氨基末端或者伯胺反应从而实现包括抗体，凝集素在内的蛋白标记。除了用作蛋白质标记物，还可用作蛋白质荧光示踪剂，标记抗体用以快速鉴定病原体，以及用于蛋白质和多肽（HPLC）的微量测序。FITC为黄-橙色粉末，最大激发波长为494 nm。一旦激发，在最大发射波长520 nm处呈黄-绿色荧光。

FITC有两种异构体，异构体I（Isomer I）和异构体II（Isomer II）,二者在光谱性质上基本没有差异（无论是波长还是光强度），但是前者更易纯化，所以相对便宜，应用也较为广泛。对于大部分应用，混合型的FITC已能很好的满足实验要求。本品Isomer I含量≥90%，适合用于蛋白质标记。

产品性质

运输和保存方法

冰袋运输。4℃干燥避光保存，2年有效。

注意事项

1）为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
2）本产品仅作科研用途！

使用方法

1. 标记蛋白

1）制备溶于0.1 M碳酸钠缓冲液（pH 9）的待交联蛋白样品，浓度≥2 mg/mL。

【注】：a）勿将碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液存放于0-5℃超过1周，其pH值会发生变化，建议现配现用。

b）待标记的蛋白必须是未被污染蛋白，且溶解蛋白的缓冲液里不能含有叠氮钠或胺类试剂，如Tris、甘氨酸，因为这些试剂会抑制标记反应。如果缓冲液里含有上述试剂，则需将该蛋白溶液在4℃下于PBS，pH 7.4 透析过夜；透析过程中如果pH值过高（＞8.0-8.5）会损害某些蛋白。

2）溶解FITC于无水DMSO配制成浓度为1 mg/mL的溶液。

【注】：于标记实验前新鲜配置FITC溶液，避光。

3）对于1 mL 蛋白溶液加入50 µLFITC溶液，可按照每次5 µL的量边加边轻轻搅拌蛋白溶液；

4）待所需FITC加入完毕，将反应液于4℃避光孵育8 h；

5）加入NH4Cl使其终浓度至50 mM，4℃终止反应2 h；

6）加入二甲苯青至浓度0.1%，甘油至浓度5%；         

7）通过大小孔径合适的凝胶过滤层析分离排除未被结合的FITC，待凝胶柱平衡后，将以上反应混合液从柱顶注入，打开凝胶柱，待其全部流入柱床后，加入PBS缓冲液。

此时，可以形成两条带：a，快速移动带，也就是FITC-蛋白偶联物，先被洗脱，通常于室内光下可看到；b，慢速移动带，也就是未结合蛋白的FITC和二甲苯青。仅仅在PBS缓冲液清洗后被洗脱出来。

8）于4℃避光储存上述偶联物，加入0.1%（w/v）叠氮化钠作为一种防腐剂。若蛋白浓度较低（＜1 mg/mL），可加入1%BSA作为一种蛋白稳定剂。

9）偶联物中荧光素和蛋白的比值（F/P）可通过测定495 nm和280 nm处的吸光值来鉴定，F/P应位于0.3-1.0。小于该比例则信号太低，高于该比例则背景太高。

2. 荧光素/蛋白摩尔比（F/P）的测定

F/P摩尔比即荧光素蛋白偶联物中FITC与蛋白质的摩尔比。为了计算该值，首先需测定该偶联物在280nm和495nm的吸光值：将已标记蛋白样品置于石英比色皿中，测得A280和A495，注意A280的值需在0.2-1.4之间，如在该范围外，需调整相应标记样品浓度。

2.1 对FITC-IgG标记物

F/P摩尔比计算公式为：Molar F/P=[2.77×A495] / [A280-（0.35×A495）]

FITC-IgG偶联物浓度计算公式为：IgG（mg/ml）=[A280-（0.35×A495）] / 1.4 

【注】：该处1.4，指的是大多数物种IgG 以浓度为1mg/ml在pH7.0的条件下测得的A280为1.4。

2.2 对于其他FITC-蛋白质（非IgG）偶联物

F/P摩尔比计算公式为

此处  ，

【注】：C对一种蛋白质而言是一常数；

MW是蛋白质分子量；

389是FITC的分子量；

195是FITC偶联物在pH13, 490 nm处的吸光值E0.1%；

（0.35×A495）是基于FITC A280的校正因子；

E0.1%是某一蛋白（1.0 mg/mL）在280 nm处的吸光值

HB190124