Percoll

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产品描述

Percoll是一种适用性广且操作灵活简单的低密度梯度分离液，可用来分离细胞，亚细胞颗粒，细菌，病毒，甚至实现受损细胞及其碎片与完整活细胞的分离。Percoll主要由表面包被单层乙烯吡咯烷酮（PVP）的硅胶颗粒组成，直径15-30 nm，游离PVP的含量仅占1-2%。由于颗粒大小的异质化，离心过程以不同的速率沉淀，自发产生一个匀质化且等渗的梯度，密度在1.0-1.3 g/mL之间。大部分沉淀系数＞60S的生物颗粒都可以用Percoll实现分离。

本品是无菌的溶液，呈无色至浅黄色，具有以下几大特点，

1）Percoll形成的梯度密度范围在1.0-1.3 g/mL之间，整个梯度体系都是等渗的；

2）无细胞毒性，化学惰性，不会粘附到细胞膜上；

3）可调节至生理离子强度和pH；

4）温和条件分离细胞，亚细胞颗粒和较大病毒（低至~70S），可保持其活力和形态完整性；

5）只需角转头中速离心即可实现预成梯度或者自发形成梯度分离；

6）Percoll粘度低（10±5 cP at 20°C），能够快速形成梯度和颗粒分离；采用预制梯度分离低速离心力（200-1000 × g）仅需数分至数十分钟即可达到满意的分离结果；

7）Percoll稳定性高，未开封的产品室温保存5年有效；开封的产品室温无菌保存至少2年有效；

8）Percoll（未稀释）可重新高压灭菌，120°C，30 min；

使用方法

1. 不同浓度（密度）Percoll溶液的制备

注意：Percoll最好稀释于缓冲液，生理盐水或0.25 M 蔗糖溶液中。细胞样本可用缓冲液如PBS来进行梯度分离；而亚细胞颗粒，有可能会在盐离子存在的情况下聚集在一起，建议使用蔗糖溶液（终浓度0.25 M）来进行梯度分离。

1）等渗Percoll溶液（SIP）的制备

也就是将未稀释的Percoll原液调整到等渗透于生理盐溶液。取9份Percoll（v/v）加入1份1.5 M NaCl，10×浓缩培养基，1.5 M PBS或2.5 M 蔗糖溶液混匀即可。可通过加入盐离子或者蒸馏水来调整渗透压到最后需要的值。细胞密度取决于渗透压，因此，SIP溶液的渗透压常规来说需要用渗压计来调整以确保实验间结果的可重复性。通过以下公式来计算SIP溶液的密度，

此公式中，V_x= volume of diluting medium (mL)；V₀= volume of undiluted Percoll (mL)

ρ₀= density of Percoll (1.130+0.005 g/mL)；

ρ₁₀= density of 1.5 M NaCl=1.058 g/mL(minor differences for other salts)；

        density of 2.5 M sucrose=1.316 g/mL(minor differences for other additives)

ρ_i= density of SIP solution produced(g/mL)

Thus, for SIP in saline, ρ_i=1.123 g/mL and for SIP in sucrose, ρ_i=1.149 g/mL, assuming ρ₀=1.130 g/mL.

2）稀释SIP溶液至更低密度

直接使用0.15 M NaCl或1×细胞培养液（正常渗透压）稀释SIP到需要的密度，用于细胞分离；直接使用0.25 M 蔗糖溶液稀释SIP用于亚细胞或者病毒分离。通过以下公式来计算调整SIP到需要的密度，

此公式中，V_y= volume of diluting medium in mL; V_i= volume of SIP in mL;

ρ_i= density of SIP in g/mL; ρ = density of diluted solution produced in g/mL;

ρ_y= density of diluting medium in g/mL

    (density of 0.15 M NaCl is～1.0046 g/mL)

    (density of 0.25 M sucrose is～1.032 g/mL)

例如：To dilute 55 mL of SIP to a final density of 1.07 g/mL,determine the amount of 0.15 M NaCl required.

Volume of 0.15 M NaCl required =55×            =44.6 mL

注意：以上公式调整得到的实际密度仅仅与预定密度非常接近，并不能保证完全相同。因为加入体积和稀释液密度的微小变化都会影响最终结果。要想知道实际密度，建议使用密度计或折射仪来测定。

2. 一步法稀释Percoll到需要密度（可选）

根据以下方法直接将Percoll原液稀释到已知密度的工作液。在量筒内，加入1.5 M NaCl或2.5 M 蔗糖到1/10终体积溶液，然后用蒸馏水稀释到最终体积量。根据以下公式计算需要的Percoll原液的体积，

此公式中，V₀= volume of undiluted Percoll (mL); V= volume of final working solution (mL);

ρ₀= density of Percoll (undiluted) (g/mL);  ρ= desired density of final solution (g/mL)

ρ₁₀= density of 1.5 M NaCl=1.058 g/mL (minor differences for other salts)

        density of 2.5 M sucrose=1.316 g/mL (minor differences for other additives)

例如：To prepare 100 mL of working solution of Percoll of density 1.07 g/mL in 0.15 M NaCl. To 10 mL of 1.5 M NaCl, add

Volume of Percoll required =100× =49.4 mL (if percoll density is 1.130 g/mL)

and make up to 100 mL with distilled water.

注意：以上公式调整得到的实际密度仅仅与预定密度非常接近，并不能保证完全相同。因为加入体积和稀释液密度的微小变化都会影响最终结果。要想知道实际密度，建议使用密度计或折射仪来测定。

3. 不连续（Discontinuous）密度梯度的制备

1） 根据以上公式将SIP溶液稀释到需要的一系列不同密度；

2） 先将试管壁用牛血清湿润，除去多余血清，这种预处理可使逐层叠加的Percoll液平稳沿管壁流下，使形成满意的界面。使用枪头或者宽口针头的注射器按照高密度向低密度逐层放置的先后顺序，紧贴管壁，任液体自然慢慢流下，确保上层溶液不会溅入下层或者混入分界处。

1. 装样：样品体积和细胞浓度根据不同细胞而异，一般加样体积不宜过大，细胞浓度也不可过高，否则会影响细胞的分离和回收。

2. 离心：一般采用离心力为400 × g，时间20～25 min。由于多层Percoll之间密度差别不大，因此离心机加速、降速时要慢，要平稳。

3. 取样：当所要分离的细胞绝大部分在两层的界面时，可逐层去除Percoll液后收集界面部位的细胞;有时大部分细胞位于Percoll层中，则需要逐层收集。